Реакции гемагглютинации, гемадсорбции, их диагностическое значение при вирусных инфекциях. Реакция гемагглютинации (РГА) Что лучше прижечь или удалить гемагглютинации

1.Реакция гемагглютинации

(РГА)

метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на наличии у некоторых вирусов способности избирательно агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

В основе РГА лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию. При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

Использование РГА

РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемагглютинирующих единиц - АЕ).

Адсорбция вирусов

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок.

Антиген для РГА

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, материал из зараженных КЭ, культур ткани и др.), в котором предполагается наличие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Постановка ориентировочной РГА

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю вирусосодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой.

Оценка реакции РГА

Оценивают реакцию в крестах (плюсах). При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осадка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробирки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста

2. Реакция торможения гемагглютинации - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами). Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической вирусологии для определения титров специфических антител к тем или иным вирусам, а также для серологической идентификации и типирования изолятов вирусов из клинического материала от больных. Используют несколько ограничено в силу наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных антител - агглютининов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Несмотря на своё название, принцип реакции во многом аналогичен РН вирусов, так как основан на способности AT связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Реакция торможения гемагглютинации

(РТГА)

метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

3. Серологическое исследование позволяет поставить диагноз в случае обнаружения специфических антител в сыворотке больных. Для серологических реакций используют парные сыворотки, которые берут в первые дни от начала заболевания и спустя 1 - 3 недели, но изучают одновременно. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более. РТГА, РН, РСК, РТГадс, РИФ, РИА, ИФА ставят с антигенами (диагностикума-ми), приготовленными из эталонных штаммов соответствующих вирусов.

4. Парные - это значит, что кровь дважды берут с каким-то интервалом времени. По нарастанию титра антител определяют, что заражение произошло. Если титр антител не меняется, значит, эти антитела в организме уже давно, свежего заражения нет.

Наибольшую диагностическую ценность представляет исследование парных сывороток, взятых от животных в начале и в конце заболевания (с промежутком в 14-21 день). Сыворотку отбирают в стерильные пробирки и хранят для исследования.

Описание

Набор для диагностики парвовирусной болезни свиней предназначен для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов в реакции гемагглютинации (РГА) и специфических антител в сыворотке крови свиней, а также новорожденных поросят (до приема молозива) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Реакцию ставят микрометодом в лунках полистироловых пластин.

полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций;

антиген специфический инактивированный, обладающий гемагглютинирующей активностью не ниже 1:128;

сыворотка специфическая, обладающая активностью в РТГА не ниже 1:256;

сыворотка нормальная (отрицательный контроль).

Время проведения анализа:

РГА – 2,5-3,5 часа, РТГА – 3,5-4,5 часа (не учитывая время подготовки материалов для исследования).

Принцип метода:

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на склеивании взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием гемагглютинирующих свойств вируса и образования рыхлого осадка в виде зонтика. Сущность РТГА заключается в нейтрализации гемагглютинирующих свойств вируса специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови, в результате чего не происходит склеивания эритроцитов и они оседают на дно, образуя плотный осадок в виде пуговки.

Условия хранения

Набор хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С.

После растворения компоненты набора можно хранить в замороженном состоянии в течение 1 месяца, повторное замораживание не допускается.

Срок годности

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

Реакцию агглютинации можно проводить в микроварианте в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических исследований с коническим дном. В лунки планшета вносят по 0,05 мл ФСБ (рН 7,2-7,4) и готовят двукратные разведения испытуемых сывороток крови от 1:2 и выше. Затем в каждую ячейку вносят по 0,005 мл суспензии грибных клеток в концентрации 100 тыс. грибных клеток в 1 мл. Планшет осторожно встряхивают и выдерживают 2 часа в термостате при 37°С, а затем 16-18 часов - при 4°С. В качестве отрицательного контроля используют нормальную (негативную) сыворотку крови и ФСБ.

Результаты реакции учитывают с помощью микроскопа и визуально и определяют в крестах по следующей схеме:

(++++) - полное просветление жидкости и образование агглютината на дне лунки в виде перевернутого "зонтика", при встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья;

(+++) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик";

(++) - заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен умеренно;

(+) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен слабо;

(-) - отрицательный результат, просветление жидкости не наступило, на дне лунки осадок в виде пуговки, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимали последнее разведение испытуемой сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в два креста (++).

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ

гемагглютина́ция (от греч. háima кровь и лат. agglutinatio склеивание), склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием бактерий, вирусов, токсинов и др., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также гемагглютининов. Эритроциты одного животного могут агглютинироваться сывороткой другого вследствие наличия в ней нормальных изогемагглютининов (антител). С помощью реакции Г. устанавливают . Феномен Г. используется при микробиологическом и иммунологическом исследованиях.

Различают прямую, или активную, и непрямую, или пассивную, Г. Прямая Г. обусловлена непосредственным воздействием бактериальных и вирусных агентов на эритроциты. При этом гемагглютинины с помощью фермента муциназы взаимодействуют с расположенными на поверхности эритроцитов рецепторами мукопротеазной природы, вызывая адсорбцию антигена. В результате взвесь эритроцитов (например, курицы) образует широкий осадок в форме зонтика с неровными краями. Эта реакция не является специфической, протекает без участия иммунной сыворотки. Прямую Г. применяют в серологических исследованиях, в частности при определении рабочего разведения антигена, используемого в реакции торможения Г. , в основе которой лежит задержка гемагглютинирующего действия антигена иммунной специфической сывороткой. Прямую Г. используют также для ориентировочной диагностики некоторых вирусных болезней (инфлюэнцы лошадей, чумы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа уток). Непрямая Г. (РНГА) основана на способности сенсибилизированных эритроцитов (путём адсорбции на них антигена) агглютинироваться гомологичными антителами иммунной сыворотки. Благодаря высокой чувствительности и специфичности непрямой Г. её применяют для диагностики многих вирусных, бактериальных и риккетсиозных заболеваний. Существует несколько модификаций непрямой Г. реакции торможения, задержки, нейтрализации антител и др. С помощью РНГА и её модификаций могут быть выявлены как антитела в сыворотке крови животных и человека (при использовании эритроцитов, сенсибилизированных известным антигеном), так и антиген (при использовании эритроцитов, сенсибилизированных определёнными антителами). Для реакции применяют отмытые эритроциты разных видов животных (наиболее часто эритроциты барана и курицы). Способность эритроцитов к адсорбции крупномолекулярных антигенов белковой природы повышается после обработки их танином. Для повышения срока хранения эритроцитов их консервируют формалином. Полученные из формализированных эритроцитов диагностикумы могут длительное время сохранять свою активность. При наличии готовых эритроцитарных диагностикумов постановка реакции значительно упрощается. В ветеринарной практике РНГА применяют для диагностики некоторых (преимущественно вирусных) болезней животных классической чумы птиц ньюкаслской болезни, оспы коров, инфлюэнцы лошадей, гриппа свиней и уток, пуллороза тифа птиц и др. См. также , .

Литература:
Лабораторные исследования в ветеринарии, М., 1971;
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера 2 изд., М., 1973.

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Синонимы :

Смотреть что такое "ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ" в других словарях:

гемагглютинация - гемагглютинация … Орфографический словарь-справочник

гемагглютинация - скучивание, агглютигация Словарь русских синонимов. гемагглютинация сущ., кол во синонимов: 2 агглютигация (3) … Словарь синонимов

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ - (от гемо... и лат. agglutinatio склеивание) склеивание и выпадение в осадок взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием различных агентов, напр., антител, бактерий или вирусов. Реакция гемагглютинации применяется для диагностики… … Большой Энциклопедический словарь

Гемагглютинация - процесс склеивания эритроцитов в видимые невооруженным глазом агрегаты. Г. вызывают: 1) Ат к эритроцитарным и гетерофильным Аг; 2) Ат к чужеродным для эритроцитов Аг, адсорбированным на их поверхности (см. Гемагглютина ции реакция пассивная); 3) … Словарь микробиологии

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ - ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ, аглютинация (ску чивание) эритроцитов при смешивании с гомологичными сыворотками. Если человеческие эритроциты сменить с сывороткой того же лица, то при встряхивании получится равномерная взвесь. Если эритроциты одного лица… … Большая медицинская энциклопедия

гемагглютинация - Феномен, лежащий в основе способа определения антител, основанного на агглютинации ими эритроцитов в результате связывания либо с антигенами самих эритроцитов, либо с другими антигенами, искусственно присоединенными к поверхности эритроцитов.… … Справочник технического переводчика - (гем + агглютинация) агглютинация эритроцитов … Большой медицинский словарь

Гемагглютинация - от греч. haima кровь и лат. agglutinatio склеивание), процесс склеивания и последующего осаждения эритроцитов крови; вызывается гемагглютининами (См. Гемагтлютинины), бактериями и вирусами, агентами, способными адсорбироваться на… … Большая советская энциклопедия

гемагглютинация - склеивание (агглютинация) эритроцитов. Развивается, в том числе и при переливании несовместимой крови.

Главная → Анализы → Иммунологический метод → Реакции гемагглютинации (иммунологический метод)

Реакции агглютинации основаны на взаимодействии реагента (антител) с антигенами, находящимися на поверхности клеток или инородных частиц. В результате образуются агрегаты крупного размера, которые выпадают в осадок и их можно увидеть даже невооруженным глазом. Таким образом определяют группу крови по системе АВО, наличие в ней резус-фактора и др. Это более чувствительный по сравнению с реакциями преципитации способ диагностики, так как объем осадка (агглютината) превосходит объем преципитата.

Прямая гемагглютинация

Реакция прямой гемагглютинации (РПГА) используется для выявления поверхностных антигенов микроорганизмов и эритроцитов, а также антител к ним.
К стандартным сывороткам, содержащим антитела, добавляют исследуемый материал (кровь). Скорость прямой реакции агглютинации связана с количеством исследуемого материала, количеством и концентрацией сыворотки, температурой окружающей среды.

Непрямая гемагглютинация

Реакцию непрямой гемагглютинации проводят для выявления антител в крови пациента с помощью эритроцитарного диагностикума. Реагент представляет собой эритроциты, на поверхности которых расположен антиген (белки микроорганизмов, токсинов, аллергенов и др.).
Сыворотку крови пациента разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, затем добавляют эритроцитарный диагностикум и отслеживают результат. Этот высокочувствительный способ диагностики выявляет антигены даже в небольших концентрациях.

Реакция гемагглютинации (РГА).

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+».

Реакция гемагглютинации

Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.

Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.

Постановка реакции. Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.

Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.

Контрольные вопросы.

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РКС-сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.

Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к. нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").

Компоненты, реакции связывания комплемента:

1. Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,

реже взвесь микроорганизмов.

2. Антитело — сыворотка больного.

3. Комплемент — сыворотка морских свинок.

4. Антиген — эритроциты барана.

5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.

6. Изотонический раствор.

Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,

они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме-няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби-рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше-нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план-шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель-ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру-жевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эрит-роцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс-ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос-тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от-ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па-лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум?

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.

В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Методика постановки реакций. Реакция коагглютинации.

— фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
— обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
— сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Реакция коагглютинации (РКА)

Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум).
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Агглютинирующие сыворотки: что они содержат; как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки?

Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7-8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител.

Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам?

Монорецепторные сыворотки — сыворотки, содержащие антитела толь-ко к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции аг-глютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими об-щий антиген. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они спо-собны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат ан-титела к бактериям, имеющим общие антигены.

Реакция гемагглютинации. Описание и применение

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Реакция Видаля . Со второй недели заболевания в крови больных накапливаются антитела против возбудителя инфекции. Для их выявления исследуют сыворотку крови больного в реакции агглютинации. В качестве антигена используют убитые культуры сальмонелл - диагностикумы.

Для постановки реакции Видаля используют сыворотку больного, набор диагностикумов, изотонический раствор натрия хлорида.

Кровь (2-3 мл) из мякоти пальца или локтевой вены собирают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию. В лаборатории пробирку ставят в термостат на 20-30 мин для образования сгустка, затем пастеровской пипеткой обводят сгусток, чтобы отделить от стенки пробирки, и ставят на 30-40 мин на холод. Отделившуюся сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции агглютинации с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифов. Для получения сыворотки кровь можно отцентрифугировать.

При возникновении инфекционного процесса - брюшного тифа или паратифов - в организме вырабатываются О- и Н-антитела к одноименным антигенам возбудителя.

О-антитела появляются первыми и исчезают довольно быстро. Н-антитела сохраняются долго. То же самое происходит и при вакцинации, поэтому положительная реакция Видаля с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии заболевания, а реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших (анамнестическая реакция), и у привитых (прививочная). Исходя из этого, реакцию Видаля ставят раздельно с О- и Н-антигенами (диагностикумы).

Так как клинически брюшной тиф и паратифы А и В сходны, то для выявления природы заболевания сыворотку больного испытывают одновременно с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифа А и В.

Реакцию Видаля широко используют, так как она проста и не требует специальных условий.

Поставить реакцию можно двумя способами: капельным и объемным (см. главу 12). В практике чаще используют объемный метод. При постановке линейной реакции агглютинации количество рядов должно соответствовать количеству антигенов (диагностикумы). Возбудителем заболевания считают микроорганизм, диагностикум из которого агглютинировался сывороткой больного. Иногда отмечают групповую агглютинацию, так как возбудители тифа и паратифов обладают общими групповыми антигенами. В этом случае положительным считают результат реакции в ряду, в котором агглютинацию отмечают в большем разведении сыворотки (табл. 36).

Таблица 36. Возможный результат реакции агглютинации

Примечание. В практике реакцию Видаля ставят с четырьмя диагностикумами: брюшного тифа "О" и "Н", а паратифов А и В - с диагностикумами "ОН".

Если агглютинация возникает только в небольших разведениях сыворотки - 1:100, 1:200, то для отличия реакции при заболевании от прививочной или анамнестической прибегают к повторной постановке реакции агглютинации через 5-7 дней. У больного титр антител повышается, а у привитого или переболевшего не изменяется. Таким образом, нарастание титра антител в сыворотке крови служит показателем заболевания.

В ответ на внедрение в организм возбудителей брюшного тифа, обладающих Vi-антигеном, в крови больного появляются Vi-агглютинины. Их определяют со 2-й недели болезни, но титр их обычно не превышает 1:10. Обнаружение Vi-антител связывают с наличием в организме возбудителей брюшного тифа, поэтому определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет выявить бактерионосителей.

Реакция Vi-гемагглютинации . Это наиболее чувствительная реакция для выявления антител.

Принцип реакции заключается в том, что эритроциты человека (I группы) или барана после специальной обработки могут адсорбировать на своей поверхности Vi-антиген и приобретают при этом способность агглютиниповаться соответствующими Vi-антителами.

Эритроциты с адсорбированными на поверхности антигенами называют эритроцитарными диагностикумами.

Для постановки реакции Vi-гемагглютинации берут:

1) сыворотку крови больного (1-2 мл); 2) эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум; З) Vi-сыворотку; 4) О-сыворотку; 5) изотонический раствор натрия хлорида.

Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в пластмассовых пластинах с лунками.

Кровь у больного берут так же, как для реакции Видаля. Получают сыворотку. Из сыворотки готовят двукратные серийные разведения, начиная с 1:10 до 1:160.

По 0,5 мл каждого разведения вносят в лунку и прибавляют по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию ставят в объеме 0,75 мл.

Контролем служат: 1) стандартная агглютинирующая монорецепторная сыворотка + диагностикум - реакция должна быть положительной до титра сыворотки; 2) диагностикум в изотоническом растворе натрия хлорида (контроль) - реакция должна быть отрицательной.

Содержимое лунок тщательно перемешивают, ставят в термостат на 2 ч и оставляют при комнатной температуре до следующего дня (на 18-24 ч).

Учет начинают с контроля. Реакцию оценивают в зависимости от степени агглютинации диагностикума.

Результаты учитывают по четырехкрестной системе:

Эритроциты полностью агглютинированы - осадок на дне лунки в виде "зонтика";

+++ "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

++ "зонтик" маленький, на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов;

Реакция отрицательная; эритроциты не агглютинировались и осели на дно лунки в виде пуговки.

Контрольные вопросы

1. В какой период заболевания ставят реакцию Видаля?

2. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции Видаля?

3. С какими диагностикумами ставят реакцию Видаля?

4. Какая из серологических реакций является самой чувствительной при диагностике тифопаратифозных инфекций?

5. Каким диагностикумом пользуются при постановке реакции Vi-гемагглютинации?

6. Какой сывороткой определяют наличие Vi-антигена у исследуемой культуры?

7. Какое значение имеет определение Vi-фаготипа?

Возьмите у преподавателя О- и Н-диагностикумы из сальмонелл тифа, паратифа А и паратифа В и сыворотку больного. Поставьте реакцию Видаля.

Питательные среды

Среды ЭМС, Плоскирева, висмут-сульфитный агар выпускаются медицинской промышленностью в виде сухого порошка. Их готовят согласно указаниям на этикетке: отвешивают определенное количество порошка, наливают соответствующее количество воды, кипятят и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда Рассела . В 950 мл дистиллированной воды добавляют 40 г сухой питательной среды и прибавляют 5 г питательного агара. Нагревают до кипения и растворения порошков. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г х. ч. глюкозы и добавляют к приготовленной смеси. Среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл, стерилизуют текучим паром (2 дня по 2 мин) и скашивают так, чтобы оставался столбик. Среду Рассела с маннитом и сахарозой готовят так же.

Среда Олькеницкого из сухого агара . 2,5 г сухого питательного агара расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50° С агар прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре (этикетке). Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром (3 дня по 20 мин) и затем скашивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.