Az enzimreakciók sebességének függése a szubsztrátok, enzimek koncentrációjától és a hőmérséklettől. Az enzim reakciósebessége

TANFOLYAM MUNKA

Az enzimatikus reakciók kinetikája

Bevezetés

Minden szervezet élettevékenységének alapja a kémiai folyamatok. Az élő szervezetben szinte minden reakció természetes biokatalizátorok - enzimek - részvételével megy végbe.

Berzelius 1835-ben elsőként javasolta, hogy egy élő szervezet reakciói egy új erőnek köszönhetőek, amelyet „katalitikusnak” nevezett. Ezt az elképzelést főként arra a kísérleti megfigyelésre alapozta, hogy a burgonyából származó diasztáz gyorsabban hidrolizálja a keményítőt, mint a kénsav. Kuhne már 1878-ban enzimnek nevezte azt az anyagot, amelynek katalitikus ereje van egy élő szervezetben.

Az enzimhatás kinetikája az enzimológia egyik ága, amely az enzimek által katalizált reakciósebesség függését vizsgálja a szubsztrát és az enzim kölcsönhatásának kémiai természetétől és körülményeitől, valamint a környezeti tényezőktől. Más szóval, az enzimkinetika lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük az enzimatikus katalízis sebességét befolyásoló tényezők molekuláris hatásmechanizmusának természetét. Ez a rész olyan tudományok metszéspontjában jött létre, mint a biokémia, a fizika és a matematika. A legkorábbi kísérletet az enzimreakciók matematikai leírására Duclos tette 1898-ban.

Valójában ez az enzimek tanulmányozásáról szóló rész korunkban nagyon fontos, nevezetesen a gyakorlati orvoslás szempontjából. Eszközt ad a farmakológusoknak a sejtanyagcsere célzott változásaihoz, nagyszámú gyógyszert és különféle mérgeket - ezek enzimgátlók.

Ennek a munkának az a célja, hogy megvizsgálja a reakciósebesség különböző tényezőktől való függését, hogyan szabályozható és hogyan határozható meg a reakciósebesség.

1. Michaelis-Menten kinetika

Az enzimreakciók kinetikáját vizsgáló előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a reakciósebesség az elméleti várakozásokkal ellentétben nem úgy függ az enzim (E) és a szubsztrát (S) koncentrációjától, mint egy hagyományos szekunder reakció esetén. parancs reakciót.

Brown és tőle függetlenül Henri először feltételezte, hogy a reakció során enzim-szubsztrát komplex képződik. Ezt a feltételezést három kísérleti tény erősítette meg:

a) a papain oldhatatlan vegyületet képez fibrinnel (Wurtz, 1880);

b) az invertáz szubsztrát szacharóz megvédheti az enzimet a termikus denaturációtól (O" Sullivan és Thompson, 1890);

c) kimutatták, hogy az enzimek sztereokémiailag specifikus katalizátorok (Fisher, 1898-1899).

Bevezették a maximális sebesség fogalmát, és ezt megmutatták telítettségi görbe(azaz a reakciósebesség függése a szubsztrát koncentrációjától) egyenlő oldalú hiperbola. Bebizonyították, hogy a maximális megfigyelt sebesség a görbe egyik aszimptotája, az abszcissza tengelyen (a negatív értékeinek tartományában) pedig a második aszimptota által levágott szakasz, azaz. állandó a sebességegyenletben, abszolút értékben egyenlő a maximális sebesség felének eléréséhez szükséges hordozókoncentrációval.

Michaelis és Menten azt javasolták, hogy a reakciósebességet az ES komplex szétesése határozza meg, i.e. konstans k 2 . Ez csak akkor lehetséges, ha k 2 - a legkisebb sebességi állandó. Ebben az esetben az enzim-szubsztrát komplex, a szabad enzim és a szubsztrát közötti egyensúly a reakció sebességéhez képest gyorsan létrejön (gyorsan kialakult egyensúly).

A kezdeti reakciósebesség a következő képlettel fejezhető ki:

v = k 2

Mivel az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója egyenlő

K S = [E] [S] / = k -1 /k 1

akkor a szabad enzim koncentrációja úgy fejezhető ki

[E] =K S / [S]

A reakcióelegy teljes enzimkoncentrációját a képlet határozza meg

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

A reakció akkor éri el a maximális sebességet, ha a szubsztrát koncentrációja elég magas ahhoz, hogy az összes enzimmolekula ES komplex formájában jelen legyen (végtelenül nagy szubsztrátfelesleg). A kezdeti sebesség és az elméletileg lehetséges maximális sebesség aránya megegyezik az [ES] és [E] t arányával:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Ez a klasszikus egyenlet MichaelisÉs Menten, amely 1913-as megjelenése óta évtizedekre minden enzimkinetikai vizsgálat alapelvévé vált, és bizonyos korlátokkal a mai napig az.

Később kiderült, hogy az eredeti Michaelis-Menten egyenletnek számos korlátozása volt. Tisztességes, pl. csak akkor írja le helyesen egy adott enzim által katalizált reakció kinetikáját, ha az alábbi korlátozó feltételek mindegyike teljesül:

) kinetikailag stabil enzim-szubsztrát komplex képződik;

) állandó K S az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója: ez csak akkor igaz, ha ;

) a szubsztrát koncentrációja nem változik a reakció során, azaz. a szabad szubsztrát koncentrációja megegyezik a kezdeti koncentrációjával;

) a reakciótermék gyorsan leválik az enzimről, azaz. nem képződik kinetikailag jelentős mennyiségű ES komplex;

) a reakció második szakasza irreverzibilis; pontosabban csak a kezdeti sebességet vesszük figyelembe, amikor a fordított reakció (a termék tényleges hiánya miatt) még elhanyagolható;

) csak egy szubsztrát molekula kötődik az enzim minden egyes aktív helyéhez;

) minden reagens esetében az aktivitások helyett ezek koncentrációja használható.

A Michaelis-Menten egyenlet kiindulópontként szolgál az enzimműködés kvantitatív leírásához. Hangsúlyozni kell, hogy a legtöbb enzim kinetikai viselkedése sokkal összetettebb, mint a Michaelis-Menten egyenlet alapjául szolgáló idealizált séma. Ennek az egyenletnek a levezetése feltételezi, hogy csak egy enzim-szubsztrát komplex létezik. Eközben a valóságban a legtöbb enzimreakcióban legalább két-három ilyen komplex képződik, amelyek egy bizonyos sorrendben fordulnak elő.

Itt EZ a valódi átmeneti állapotnak megfelelő komplexet, EP pedig az enzim és a reakciótermék közötti komplexet jelöli. Az is kiemelhető, hogy a legtöbb enzimes reakcióban egynél több szubsztrát vesz részt, és ennek megfelelően kettő vagy több termék képződik. A két szubsztráttal, az S 1 és S 2-vel végzett reakció során három enzim-szubsztrát komplex képződhet, nevezetesen az ES 1, ES 2 és ES 1 S 2. Ha a reakció két terméket, P1-et és P2-t eredményez, akkor legalább három további EP 1, EP 2 és EP 1 P 2 komplex lehet. Az ilyen reakciókban sok köztes szakasz van, amelyek mindegyikét saját sebességi állandó jellemzi. A két vagy több reagenst érintő enzimreakciók kinetikai elemzése gyakran rendkívül összetett, és elektronikus számítógépek használatát igényli. Az összes enzimreakció kinetikájának elemzésekor azonban mindig a fentebb tárgyalt Michaelis-Menten egyenlet a kiindulópont.

1.1 Az állandó jellegeKaz egyenletben

egyenlet enzimatikus reakció kinetikája

A második posztulátum kimondja, hogy a K S konstans az egyenletben az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója.

Briggs és Haldane 1925-ben bebizonyította, hogy az eredeti Michaelis-Menten egyenlet csak -ra érvényes, i.e. amikor az E+S ES elemi szakasz egyensúlya a következő szakasz sebességéhez képest nagyon gyorsan létrejön. Ezért az ilyen kinetikai mechanizmusok (a kezdeti Michaelis-Menten feltételtől függően, és egy lassú elemi szakaszsal rendelkeznek, amelyhez képest az összes többi elemi szakaszban gyorsan létrejön az egyensúly) úgy mondják, hogy kielégítik a „gyors egyensúly” feltevést. Ha azonban k 2 nagyságrendileg összehasonlítható k -1-gyel , Az enzim-szubsztrát komplex koncentrációjának időbeli változása a következő differenciálegyenlettel fejezhető ki:

d / dt = k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Mivel a kezdeti reakciósebességet vesszük figyelembe, pl. Abban a pillanatban, amikor a fordított reakció még nem következett be, és a prestacionárius szakasz már elmúlt, akkor a szubsztrát felesleg miatt a képződött enzim-szubsztrát komplex mennyisége megegyezik a szétesett mennyiséggel. ( stacionaritási elv, vagy Briggs és Haldane kinetika, vagy Bodenstein-elv a kémiai kinetikában) és igaz, hogy

d/dt=0

Ezt behelyettesítve a differenciálegyenletbe, megkapjuk a szabad enzim koncentrációjának kifejezését:

[E] = (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Állandósult állapot egyenlete:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Mert v = k 2, akkor azt kapjuk

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Ebben az esetben

V max = k 2 [E] T

és egyenlő a Michaelis-Menten egyenletből kapott maximális sebességgel. A Michaelis-Menten egyenlet nevezőjében szereplő állandó azonban nem K S , azok. nem az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója, hanem az ún Michaelis állandó:

K m = (k -1 + k 2) / k 1

K m csak akkor egyenlő K S-vel, ha .

Állandó esetén a nevezőben a sebességegyenletet a képlet fejezi ki

K k = k 2 / k 1

és Van Slyke szerint úgy hívják, kinetikai állandó.

A stacionárius egyenlet a differenciálegyenletből is megkapható anélkül, hogy feltételeznénk, hogy d / dt = 0. Ha az [E] = [E] T - értéket behelyettesítjük a differenciálegyenletbe, transzformációk után kapjuk

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Ahhoz, hogy ebből az egyenletből megkapjuk a stacionárius állapot egyenletét, nem szükséges, hogy d / dt = 0. Elegendő, ha a d / dt egyenlőtlenség teljesül<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

A differenciált állandósult állapot egyenlete a következő:

d / dt = T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2 ] (d [S] / dt)

Ez a kifejezés nyilvánvalóan nem egyenlő 0-val.

1.2. A Michaelis-Menten egyenlet transzformációja

Az eredeti Michaelis-Menten egyenlet egy hiperbola egyenlet, ahol az egyik állandó (V max) a görbe aszimptotája. Egy másik állandó (K m), amelynek negatív értékét a második aszimptota határozza meg, megegyezik a V max / 2 eléréséhez szükséges szubsztrátkoncentrációval. Ez könnyen ellenőrizhető, hiszen ha

v=V max / 2, akkor

V max / 2 = V max [S] / (K m + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], azaz. [S] = K m at v = V max /2.

A Michaelis-Menten egyenlet algebrai úton más formákká alakítható, amelyek kényelmesebbek a kísérleti adatok grafikus ábrázolására. Az egyik leggyakoribb transzformáció egyszerűen abból adódik, hogy az egyenlet bal és jobb oldalának reciprokát egyenlővé tesszük egymással

A transzformáció eredményeként megkapjuk a kifejezést

amelyet úgy hívnak Lineweaver-Burk egyenletek. Ezen egyenlet szerint az 1/[S] és 1/v koordinátákkal ábrázolt grafikon egy egyenes, amelynek meredeksége K m /V max, az ordináta tengelyen levágott szakasz pedig 1 /V max. Egy ilyen, kettős reciprok módszerrel megszerkesztett gráfnak megvan az az előnye, hogy lehetővé teszi a V max pontosabb meghatározását; az [S] és v koordinátákkal ábrázolt görbén V max aszimptotikus érték, és sokkal kevésbé pontosan határozható meg. A Lineweaver-Burk grafikonon az x tengelyen levágott szakasz egyenlő -1/K m. Az enzimgátlásra vonatkozóan is értékes információk nyerhetők ki ebből a grafikonból.

A Michaelis-Menten egyenlet másik transzformációja, hogy a Lineweaver-Burk egyenlet mindkét oldalát megszorozzuk V max *v-vel, és néhány további transzformáció után megkapjuk

A megfelelő grafikon v és v/[S] koordinátáiban a következőt jelenti e 4, ábra. 1]. Egy ilyen menetrend ( Edie-Hofstee diagram) nemcsak a V max és K m értékeinek nagyon egyszerű meghatározását teszi lehetővé, hanem lehetővé teszi a linearitástól való olyan lehetséges eltérések azonosítását is, amelyeket a Lineweaver-Burk diagramon nem észlelünk.

Az egyenlet más formában is linearizálható

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

Ebben az esetben az [S] / v [S]-től való függését kell ábrázolni. A kapott egyenes meredeksége max. 1/V; az ordináta és az abszcissza tengelyen levágott szakaszok (K m / V max) és (- K m) egyenlők. Ezt a grafikont a szerző neve után hívják. Haynes diagram.

A statisztikai elemzés kimutatta, hogy az Edie-Hofstee és Haynes módszer pontosabb eredményeket ad, mint a Lineweaver-Burk módszer. Ennek az az oka, hogy az Edie-Hofstee és Haynes gráfokban mind a függő, mind a független változók szerepelnek a mindkét koordinátatengelyen ábrázolt mennyiségekben.

1.3 A szubsztrátkoncentráció hatása a reakciókinetikára

Sok esetben az állandó szubsztrátkoncentráció feltétele nem teljesül. Egyrészt a szubsztrát feleslegét nem alkalmazzák egyes enzimekkel végzett in vitro reakciókban a szubsztrát enzimaktivitásának gyakran előforduló gátlása miatt. Ebben az esetben csak annak optimális koncentrációja használható, és ez nem mindig biztosítja a szükséges szubsztrát felesleget a fent tárgyalt mechanizmusok kinetikai egyenleteinek teljesítéséhez. Ezen túlmenően egy sejtben in vivo általában nem érhető el az ehhez a feltételhez szükséges szubsztrátfelesleg.

Az enzimatikus reakciókban, ahol a szubsztrát nincs feleslegben, és ezért koncentrációja a reakció során változik, az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója egyenlő

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - szubsztrát koncentrációja t = 0-nál). Ebben az esetben a kezdeti reakciósebességet (egyensúlyi állapotban) a képlet határozza meg

v= V max / (K m + )

ahol a szubsztrát koncentrációja egy időben.

Azonban két olyan esetre is lehet közelítő megoldást írni, amikor [S] o = :

), ha ez az egyenlőtlenség a t nagy értékei miatt fennáll, pl. ha a reakció során a kezdeti szubsztrátkoncentráció több mint 5%-a elfogy;

) ha az enzimkoncentráció a szubsztrát koncentrációhoz képest nem elhanyagolható és így az enzim-szubsztrát komplex koncentrációját kell figyelembe venni.

Ha t nagy és a koncentráció elhanyagolható [S]0-hoz képest, akkor az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandójának egyenlete a következő lesz:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

A reakció során változó koncentrációértékre kielégítő közelítés az ([S] 0 + )/2 érték. Mivel = [S] 0 - [P], átlagos sebesség; úgy fejezhető ki

Ezt a kifejezést és a közelítő értéket behelyettesítve a

v= V max / (K m + ),

kapunk:

Ha összehasonlítjuk az ebből a közelítésből számított értékeket a pontos, integrált Michaelis-Menten egyenletből kapott értékekkel, akkor kiderül, hogy a hiba a K m meghatározásában 1 és 4%, ha a szubsztrátum 30, illetve 50%-át fogyasztják. Következésképpen ennek a közelítésnek a hibája elhanyagolható a mérési hibához képest.

Ha a szubsztrátfogyasztás nem haladja meg a kezdeti koncentráció 5%-át, de az enzimkoncentráció olyan magas, hogy [S] 0-hoz képest nem lehet figyelmen kívül hagyni, akkor az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója egyenlő:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Megoldása viszonylag ad

A két lehetséges megoldás közül csak a negatív választható, mivel csak az felel meg a kezdeti feltételeknek: = 0, ahol [S] 0 = 0 vagy [E] T = 0. A v/V arány egyenletével analóg módon max, megkaptuk a kezdeti sebesség egyenletét. Az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandójának a fenti egyenletéből kapott másodfokú egyenlet a v = k 2 és V max = k 2 [E] T képletekkel a következő alakra redukálható:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Két korlátozó esetet kell figyelembe venni. Az első esetben [S]<

v = (V max / K m) [S] = k[S]

Így egy látszólagos elsőrendű reakciót és k=V max /K m - látszólagos elsőrendű kinetikai állandót kaptunk. A tényleges dimenziója az idő -1, de több elemi fokozat első és másodrendű sebességi állandóinak kombinációja, pl. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Látható elsőrendű feltételek mellett k a reakció előrehaladásának mértéke.

Egy másik extrém eset: [S] >> Km. Itt az állandó K m elhanyagolható [S]-hez képest, és így kapjuk v = V max.

1.4 Kinetikailag stabil enzim-termék komplex kialakulása

Ha egy reakció során kinetikailag stabil enzim-termék komplex képződik, a reakció mechanizmusa a következő:

Az állandósult állapotfeltevés segítségével felírhatjuk a differenciálegyenleteket:

d /dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 /dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Ezekből az egyenletekből az következik

= [(k -2 + k 3) / k 2 ]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Mivel v = k 3

és [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

kapunk

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ] =

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Azaz

V max = [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

Ebben az esetben már nagyon nehéz kiszámítani az egyes sebességi állandók fajlagos értékét, mivel csak ezek aránya mérhető közvetlenül. Még bonyolultabbá válik a helyzet, ha egy enzimreakció mechanizmusa összetettebbé válik, ha kettőnél több komplex vesz részt a reakcióban, mert az egyenletben természetesen sokkal nagyobb a sebességi állandók száma, és ezek összefüggései is összetettebbek.

A helyzet azonban leegyszerűsödik, ha az első komplex képződésének reverzibilis reakciója után a következő elemi szakaszok visszafordíthatatlanok. Az ennek a mechanizmusnak engedelmeskedő enzimek fontos képviselői a proteolitikus enzimek és az észterázok. Reakciójuk mechanizmusa a következőképpen írható fel:

ahol az ES egy acil-enzim intermedier, amely víz hatására bomlik. Tudunk írni

V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k kat [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 kat / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) = k 2 / K m '

Az acilezési szakasz Michaelis-állandója K m " K s. Minél nagyobb a k cat /K m arány, annál nagyobb a szubsztrát specificitása.

Az állandók meghatározása nagymértékben leegyszerűsödik, ha a kísérletet olyan nukleofil ágens (N) jelenlétében végezzük, amely képes versenyezni a vízzel. Akkor

k 3 = k 3 ’ és P i (i = 1, 2, 3) szorzatok.

v i = k macska, i [S] / (K m + [S]) macska, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) macska, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) kat, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Mivel ismert, hogy K s / k 2 = K m / k cat, és ha nincs nukleofil, akkor

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

az állandók meghatározásához pedig az 1/v N (és 1/v) - 1/[S] koordinátákban lévő egyenesek metszéspontját használhatjuk. Két, dupla inverz koordinátájú egyenes metszi egymást a második kvadránsban. Nukleofil hiányában az egyenes metszéspontja a függőleges tengellyel 1/V max és 1/k cat, a vízszintes tengellyel pedig -1/K m. Két egyenes metszéspontjának koordinátái: -1/K s és 1/k 3. Az 1/V max és 1/k 3 közötti távolság 1/k 2.

1.5 A teljes reakciókinetikai görbe elemzése

A Michaelis-Menten egyenlet eredeti formájában csak az irreverzibilis reakciókra vonatkozik, pl. olyan reakciókhoz, ahol csak a kezdeti sebességet veszik figyelembe, és a fordított reakció nem következik be a nem megfelelő mennyiségű termék miatt, és nem befolyásolja a reakció sebességét. Irreverzibilis reakció esetén a teljes kinetikai görbe könnyen elemezhető (tetszőleges t időintervallumra ), integrálva az eredeti Michaelis-Menten egyenletet. Ebben az esetben tehát továbbra is az a feltételezés marad, hogy a reakció során csak egy köztes enzim-szubsztrát komplex képződik. Mivel a t időintervallumhoz nincs korlátozás, a szubsztrát koncentrációja az analízis időpontjában nem lehet egyenlő az eredetileg bevitt koncentrációval. Így az [S] reakció során bekövetkező változását is figyelembe kell venni. Legyen S 0 a szubsztrát kezdeti koncentrációja, (S 0 - y ) - koncentráció a t időpontban . Ezután az eredeti Michaelis-Menten egyenlet alapján (ha y - átalakított hordozó mennyisége), írhatjuk

dy / dt = V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

A reciprokokat felvéve és a változókat elosztva y fölé integráljuk 0-tól y-ig terjed (V max jelölése: V):

(2,303 / t) log = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Így, miután ábrázoltuk az egyenlet bal oldalának y/t-től való függését (Foster-Niemann koordináták) , lejtős egyenest kapunk (-1/K m) , a szakasz levágása az ordináta tengelyen (V/K m) , az x tengelyen pedig a V szakasz található. Az integrál egyenlet más módon is linearizálható:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

vagy t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Ha reverzibilis reakciót vizsgálunk, akkor oda kell figyelnünk, hogy milyen időintervallumtal van dolgunk. Az enzimnek a szubsztráttal való keveredésének pillanatában megkezdődik az úgynevezett prestacionárius fázis, amely több mikro- vagy milliszekundumig tart, amely során az álló állapotnak megfelelő enzim-szubsztrát komplexek keletkeznek. Meglehetősen hosszú ideig tartó reverzibilis reakciók vizsgálatánál ennek a fázisnak nincs jelentős szerepe, mivel ebben a fázisban a reakció semmilyen irányban nem megy végbe teljes sebességgel.

A balról jobbra haladó reakciónál a reakcióban részt vevő enzim-szubsztrát komplexek csak a prestacionárius fázis végén érik el a sebességkorlátozó koncentrációt. Kvázi-stacionárius állapot, amelyben a sebesség meghatározó enzim-szubsztrát komplexek koncentrációja megközelíti a maximális koncentrációértékeket egyensúlyi állapotban, több tizedmásodpercig vagy másodpercig tart. Ebben a fázisban a termékképződés (vagy a szubsztrát-felhasználás) sebessége időben szinte lineáris. Elméletileg a termék képződése még nem történt meg, de a gyakorlatban koncentrációja olyan alacsony, hogy a fordított reakció sebessége nem befolyásolja az előrehaladó reakció sebességét. Ezt a lineáris fázist kezdeti reakciósebességnek nevezzük, és eddig csak ezt vettük figyelembe.

A következő fázisban a reakció jobbról balra a termékkoncentráció fokozatos növekedése miatt is felgyorsul (átmeneti állapot; az eddig megfigyelt időbeli linearitás eltűnik). Ez a fázis addig tart, amíg a balról jobbra haladó reakció sebessége egyenlővé nem válik a jobbról balra haladó reakció sebességével. Ez egy állapot dinamikus egyensúly, mivel a reakció mindkét irányban folyamatosan, azonos sebességgel folytatódik.

2. Tényezők, amelyektől az enzimatikus reakció sebessége függ

.1 Az enzimreakció sebességének függése a hőmérséklettől

A környezet hőmérsékletének növekedésével az enzimreakció sebessége növekszik, valamilyen optimális hőmérsékleten eléri a maximumot, majd nullára csökken. A kémiai reakciók esetében van egy szabály, hogy ha a hőmérséklet 10 °C-kal emelkedik, a reakció sebessége kétszer-háromszorosára nő. Az enzimes reakcióknál ez a hőmérsékleti együttható alacsonyabb: minden 10 °C-on a reakciósebesség 2-szeresére vagy még kevesebbre nő. A reakciósebesség ezt követő nullára csökkenése az enzimblokk denaturálódását jelzi. A legtöbb enzim optimális hőmérsékleti értéke 20-40 0 C között van. Az enzimek termolabilitása a fehérjeszerkezetükhöz kapcsolódik. Egyes enzimek már 40 0 ​​C körüli hőmérsékleten denaturálódnak, de nagy részük inaktiválódik 40 - 50 0 C feletti hőmérsékleten. Egyes enzimek hideg hatására inaktiválódnak, pl. 0°C-hoz közeli hőmérsékleten denaturálódik.

A testhőmérséklet emelkedése (láz) felgyorsítja az enzimek által katalizált biokémiai reakciókat. Könnyű kiszámítani, hogy a testhőmérséklet minden fokos emelkedése körülbelül 20%-kal növeli a reakciósebességet. Magas, 39-40°C körüli hőmérsékleten a beteg szervezet sejtjeiben az endogén szubsztrátok pazarló felhasználását táplálékkal kell pótolni. Ezenkívül körülbelül 40 °C-on néhány nagyon termolabilis enzim denaturálható, ami megzavarja a biokémiai folyamatok természetes lefolyását.

Az alacsony hőmérséklet az enzimek reverzibilis inaktivációját okozza térbeli szerkezetének enyhe változása miatt, de elegendő ahhoz, hogy megzavarja az aktív centrum és a szubsztrát molekulák megfelelő konfigurációját.

2.2 A reakciósebesség függése a közeg pH-jától

A legtöbb enzimnek van egy meghatározott pH-értéke, amelynél aktivitása a legnagyobb; E pH-érték felett és alatt ezen enzimek aktivitása csökken. Az enzimaktivitás pH-tól való függését leíró görbék azonban nem minden esetben harang alakúak; néha ez a függőség közvetlenül is kifejezhető. Az enzimreakció sebességének a pH-tól való függése elsősorban az enzim aktív centrumának funkciós csoportjainak állapotát jelzi. A tápközeg pH-értékének változása befolyásolja az aktív centrum aminosavmaradékainak savas és bázikus csoportjainak ionizációját, amelyek vagy a szubsztrát megkötésében (az érintkezési helyen), vagy annak átalakulásában (a katalitikus helyen) vesznek részt. ). Ezért a pH specifikus hatását vagy a szubsztrát enzimhez való affinitásának megváltozása, vagy az enzim katalitikus aktivitásának megváltozása, vagy mindkét ok együttesen okozhatja.

A legtöbb szubsztrátum savas vagy bázikus csoportokkal rendelkezik, így a pH befolyásolja a szubsztrát ionizációs fokát. Az enzim elsősorban a szubsztrát ionizált vagy nem ionizált formájához kötődik. Nyilvánvaló, hogy optimális pH-n az aktív hely funkciós csoportjai a legreaktívabb állapotban vannak, és a szubsztrát ezen enzimcsoportok általi megkötéséhez előnyös formában van.

Az enzimaktivitás pH-tól való függőségét leíró görbék készítésekor az összes pH-érték mérését általában az enzim szubsztráttal való telítettsége mellett végezzük, mivel sok enzim K m értéke a pH változásával változik.

Az enzimaktivitás pH-tól való függőségét jellemző görbe különösen egyszerű alakú lehet azokban az esetekben, amikor az enzim elektrosztatikusan semleges szubsztrátumokra, vagy olyan szubsztrátumokra hat, amelyekben a töltött csoportok nem játszanak jelentős szerepet a katalitikus hatásban. Az ilyen enzimekre példa a papain, valamint az invertáz, amely katalizálja a semleges szacharózmolekulák hidrolízisét, és állandó aktivitást tart fenn a 3,0-7,5 pH-tartományban.

A maximális enzimaktivitásnak megfelelő pH-érték nem feltétlenül esik egybe ezen enzim normál intracelluláris környezetére jellemző pH-értékkel; ez utóbbi lehet a pH-optimum felett és alatt is. Ez arra utal, hogy a pH enzimaktivitásra gyakorolt ​​hatása lehet az egyik olyan tényező, amely felelős a sejten belüli enzimaktivitás szabályozásáért. Mivel a sejt több száz enzimet tartalmaz, és mindegyik eltérően reagál a pH változásaira, a sejten belüli pH-érték talán az egyik fontos eleme a sejtanyagcsere komplex szabályozási rendszerének.

2.3 Az enzim mennyiségének meghatározása aktivitása alapján

) a katalizált reakció általános sztöchiometriája;

) lehetséges kofaktorok szükségessége - fémionok vagy koenzimek;

) az enzimaktivitás szubsztrát- és kofaktorkoncentrációtól való függése, i.e. K m értékek mind a szubsztrátumra, mind a kofaktorra;

) a maximális enzimaktivitásnak megfelelő pH-érték;

) azt a hőmérsékleti tartományt, amelyen az enzim stabil és megőrzi magas aktivitását.

Ezenkívül szükség van néhány meglehetősen egyszerű analitikai technikára, amely lehetővé teszi a szubsztrát eltűnésének vagy a reakciótermékek megjelenésének sebességének meghatározását.

Amikor csak lehetséges, az enzimvizsgálatokat olyan standard körülmények között végezzük, amelyek az optimális pH-t és a szubsztrátkoncentrációt a telítési koncentráció felett tartják; ebben az esetben a kezdeti sebesség nulladrendű reakciónak felel meg a szubsztráthoz képest, és csak az enzim koncentrációjával arányos. A kofaktorokat - fémionokat vagy koenzimeket - igénylő enzimek esetében ezeknek a kofaktoroknak a koncentrációjának is meg kell haladnia a telítési koncentrációt, így az enzimkoncentráció a reakció sebességkorlátozó tényezője. Jellemzően a termékképződés sebességének mérése nagyobb pontossággal végezhető, mint a szubsztrát eltűnésének sebességének mérése, mivel a szubsztrátumnak jellemzően viszonylag magas koncentrációban kell jelen lennie a nulladrendű kinetika fenntartásához. A reakciótermék (vagy termékek) képződési sebessége kémiai vagy fotometriai módszerekkel mérhető. A második módszer kényelmesebb, mivel lehetővé teszi a reakció előrehaladásának folyamatos rögzítését a felvevőn.

A nemzetközi megállapodások szerint az enzimaktivitás egysége az az enzimmennyiség, amely optimális körülmények között 25 °C-on percenként egy mikromol szubsztrát átalakulását képes előidézni. Konkrét tevékenység Az enzim az enzimaktivitás egységeinek száma 1 mg fehérjére vonatkoztatva. Ezt az értéket használják az enzimkészítmény tisztaságának kritériumaként; az enzim tisztításával növekszik, és eléri az ideálisan tiszta készítmény maximális értékét. Alatt fordulatok száma megérteni az egységnyi idő alatt átalakuló szubsztrátmolekulák számát egy enzimmolekulánként (vagy aktív centrumonként) olyan körülmények között, ahol a reakció sebességét az enzimkoncentráció korlátozza.

2.4 Enzimaktiválás

Az enzimek szabályozása különböző biológiai komponensek vagy idegen vegyületek (például gyógyszerek és mérgek) velük való kölcsönhatása révén valósulhat meg, amelyeket általában ún. módosítók vagy szabályozók enzimek. Az enzimet módosító szerek hatására a reakció felgyorsulhat (aktivátorok) vagy lelassulhat ( inhibitorok).

Az enzimaktivációt a biokémiai reakciók felgyorsulása határozza meg, amely a módosító hatása után következik be. Az aktivátorok egyik csoportja olyan anyagokból áll, amelyek befolyásolják az enzim aktív központjának régióját. Ezek közé tartoznak az enzimkofaktorok és szubsztrátok. A kofaktorok (fémionok és koenzimek) nemcsak a komplex enzimek kötelező szerkezeti elemei, hanem lényegében azok aktivátorai is.

A fémionok meglehetősen specifikus aktivátorok. Egyes enzimekhez gyakran nem egy, hanem több fém ionjaira van szükség. Például az egyértékű kationokat a sejtmembránon keresztül szállító Na +, K + -ATPázhoz magnézium-, nátrium- és káliumionok szükségesek aktivátorként.

A fémionokkal történő aktiválás különböző mechanizmusokon keresztül történik. Egyes enzimekben a katalitikus hely részét képezik. Egyes esetekben a fémionok megkönnyítik a szubsztrát kötődését az enzim aktív központjához, egyfajta hidat képezve. A fém gyakran nem az enzimmel, hanem a szubsztráttal egyesül, fém-szubsztrát komplexet képezve, ami előnyös az enzim működéséhez.

A koenzimek szubsztrát megkötésében és katalízisében való részvételének specifitása magyarázza az enzimreakciók aktiválását. A kofaktorok aktiváló hatása különösen akkor érezhető, ha olyan enzimre hatnak, amely nem telített kofaktorokkal.

A szubsztrát bizonyos koncentrációs határokon belül aktivátor is. A szubsztrát telítő koncentrációjának elérése után az enzimaktivitás nem növekszik. A szubsztrát növeli az enzim stabilitását és elősegíti az enzim aktív centrumának kívánt konformációjának kialakulását.

Fémionok, koenzimek és prekurzoraik és aktív analógjaik,

A szubsztrátok a gyakorlatban enzimaktiváló gyógyszerként használhatók.

Egyes enzimek aktiválása végrehajtható olyan módosításokkal, amelyek nem befolyásolják molekuláik aktív centrumát. Ennek a módosításnak több lehetősége is van:

1) egy inaktív előd aktiválása - proenzim, vagy zimogén. Például a pepszinogén átalakítása pepszinné ;

2) aktiválás bármely specifikus módosító csoportnak az enzimmolekulához való kapcsolásával;

3) aktiválása az inaktív fehérje-aktív enzim komplex disszociációjával.

2.5 Enzimgátlás

Vannak olyan reagensek, amelyek többé-kevésbé specifikusan kölcsönhatásba léphetnek a fehérjék egyik vagy másik oldalláncával, ami az enzimaktivitás gátlásához vezet. Ez a jelenség lehetővé teszi az ezen enzimatikus reakcióban részt vevő aminosav-oldalmaradékok természetének tanulmányozását. A gyakorlatban azonban számos finomságot figyelembe kell venni, ami megnehezíti és gyakran megkérdőjelezi a specifikus inhibitorokkal kapott eredmények egyértelmű értelmezését. Először is, ahhoz, hogy egy inhibitorral végzett reakció alkalmas legyen a reakcióban részt vevő oldalláncok természetének vizsgálatára, a következő kritériumoknak kell megfelelnie:

) legyen konkrét, pl. az inhibitornak csak a kívánt csoportokat kell blokkolnia;

) gátolják az enzimaktivitást, és ennek a gátlásnak teljessé kell válnia a módosított csoportok számának növekedésével;

) a reagens nem okozhatja a fehérje nem specifikus denaturálódását.

Az inhibitoroknak 2 csoportja van: reverzibilis és irreverzibilis. A felosztás azon a kritériumon alapul, hogy az enzimaktivitás helyreáll dialízis vagy enzimoldat inhibitorral történő erős hígítása után.

A hatásmechanizmus szerint megkülönböztetünk kompetitív, nem kompetitív, nem kompetitív, szubsztrát és alloszterikus gátlást.

Kompetitív gátlás

A kompetitív gátlást a szubsztrát analógok által okozott gátlás vizsgálatával fedezték fel. Ez egy olyan enzimreakció gátlása, amelyet egy, a szubsztráthoz hasonló szerkezetű inhibitor kötődése okoz az enzim aktív központjához, és megakadályozza az enzim-szubsztrát komplex kialakulását. A kompetitív gátlásban az inhibitor és a szubsztrát szerkezete hasonló, versenyez az enzim aktív helyéért. A nagyobb molekulák vegyülete az aktív centrumhoz kapcsolódik.

A gátlás mechanizmusára vonatkozó ilyen elképzeléseket a kompetitív gátlási reakciók kinetikájával kapcsolatos kísérletek igazolták. Így kimutatták, hogy kompetitív gátlás esetén a szubsztrát analóg nem befolyásolja a már kialakult enzim-szubsztrát komplex bomlási sebességét, azaz. "végtelenül nagy" szubsztrátfelesleg alkalmazásakor ugyanazt a maximális sebességet érjük el mind az inhibitor jelenlétében, mind távollétében. Éppen ellenkezőleg, az inhibitor befolyásolja a disszociációs állandó és a Michaelis-állandó értékét. Ebből arra következtethetünk, hogy az inhibitor reakcióba lép azokkal a fehérjecsoportokkal, amelyek így vagy úgy részt vesznek a szubsztrát megkötésében, ezért ezekkel a csoportokkal való kölcsönhatása miatt csökken a szubsztrát kötődési ereje (azaz az enzimmolekulák száma). képes megkötni a szubsztrátot csökken) .

Később kiderült, hogy kinetikailag kompetitív gátlást nemcsak szubsztrát analógok okozhatnak, hanem más reagensek is, amelyek kémiai szerkezete teljesen eltér a szubsztrát szerkezetétől. Ezekben az esetekben azt is feltételezték, hogy a reagens kölcsönhatásba lép a szubsztrátkötésért felelős csoporttal.

A kompetitív gátlásra elméletileg két lehetőség létezik:

1) az enzim kötő- és katalitikus központjai átfedik egymást; az inhibitor kötődik hozzájuk, de csak a kötőközpont csoportjait érinti;

2) az enzimmolekulában a kötőközpont és a katalitikus centrum térben elkülönül; az inhibitor kölcsönhatásba lép a kötőhellyel.

ahol I egy inhibitor, KI pedig az enzim-inhibitor komplex disszociációs állandója.

Relatív sebesség (az enzimreakció sebességének aránya inhibitor jelenlétében (v i) , maximális sebességre) egyenlő

v i / V = ​​​​/ [E] T

hiszen a teljes enzimkoncentrációra igaz

[E] T = [E] + +

akkor 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Nyilvánvalóan, ha [I] = K I , akkor az egyenes meredeksége kétszer akkora lesz, mint az 1/v 0 [S]-től való függése esetén (v 0 az enzimreakció sebessége inhibitor hiányában).

A gátlás típusát általában grafikusan határozzák meg. A kompetitív gátlást a legkönnyebben Lineweaver-Burk diagramok ábrázolásával ismerhetjük fel (azaz 1/v i koordinátákban ábrázoljuk). és 1/[S]) különböző inhibitorkoncentrációkban. Valódi kompetitív gátlással egy sor egyenes vonalat kapunk, amelyek a dőlésszög tangensében különböznek és metszik az ordináta tengelyt (1/v i tengely) egy ponton. Bármilyen inhibitorkoncentrációnál lehetséges olyan magas szubsztrátkoncentráció alkalmazása, hogy az enzimaktivitás maximális legyen.

A kompetitív gátlásra példa a különböző anyagok hatása a szukcinát-dehidrogenáz aktivitására. Ez az enzim a ciklikus enzimrendszer – a Krebs-ciklus – része. Természetes szubsztrátja a szukcinát, hasonló kompetitív inhibitora pedig az oxaloacetát, amely ugyanannak a Krebs-ciklusnak a közbenső terméke:

A szukcinát-dehidrogenáz hasonló kompetitív inhibitora a malonsav, amelyet gyakran használnak biokémiai vizsgálatokban.

A kompetitív gátlás elve számos farmakológiai gyógyszer, mezőgazdasági kártevők elpusztítására használt peszticid és vegyi harci szer hatásának alapja.

Például az antikolinészteráz gyógyszerek egy csoportja, amelyek kvaterner ammóniumbázisok származékait és szerves foszforvegyületeket tartalmaznak, kompetitív inhibitorai a kolinészteráz enzimnek az acetilkolin szubsztrátjához képest. A kolinészteráz katalizálja az acetilkolin hidrolízisét, amely a kolinerg rendszerek (neuromuszkuláris szinapszisok, paraszimpatikus rendszer stb.) közvetítője. Az antikolinészteráz anyagok versengenek az acetilkolinnal az enzim aktív helyéért, ahhoz kötődnek és leállítják az enzim katalitikus aktivitását. Az olyan gyógyszerek, mint a prozerin, fizosztigmin, szevin reverzibilisen gátolják az enzim működését, a szerves foszfortartalmú gyógyszerek, mint az armin, nibufin, klorofosz, szomán pedig irreverzibilisen hatnak, foszforilezve az enzim katalitikus csoportját. Hatásuk következtében az acetilkolin felhalmozódik azokban a szinapszisokban, ahol az idegi izgalom közvetítője, azaz. a szervezetet megmérgezi a felgyülemlett acetilkolin. A reverzibilis inhibitorok hatása fokozatosan elmúlik, mivel minél több acetilkolin halmozódik fel, annál gyorsabban kiszorítja az inhibitort a kolinészteráz aktív centrumából. Az irreverzibilis inhibitorok toxicitása összehasonlíthatatlanul nagyobb, ezért mezőgazdasági kártevők, háztartási rovarok és rágcsálók (például klorofosz) irtására, valamint vegyi harci szerként (például szarin, somán stb.) használják őket.

Nem kompetitív gátlás

Nem kompetitív gátlásban a specifikus inhibitor nem befolyásolja az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandóját. Másrészt a maximális elérhető reakciósebesség inhibitor jelenlétében kisebb, mint annak hiányában, még végtelenül nagy szubsztrátfelesleg esetén is. A gátlás jelenléte bizonyítja, hogy az inhibitor kötődik a fehérjéhez. A disszociációs állandó invarianciája az inhibitor jelenlétében és hiányában is azt jelzi, hogy a szubsztráttal ellentétben az inhibitor egy másik csoporthoz kötődik. Elméleti szempontból az ilyen gátlás mechanizmusa többféleképpen értelmezhető.

a) Az enzim kötőközpontja és katalitikus centruma eltérő. Ebben az esetben a katalitikus központhoz kapcsolódó inhibitor csökkenti az enzim aktivitását és az elért maximumot
sebességet anélkül, hogy befolyásolná az enzim-szubsztrát komplex képződését.

b) A kötőközpont és a katalitikus központ átfedi egymást
az enzim felszínén, és az inhibitor a fehérje más csoportjaihoz kötődik. Az inhibitornak az enzim felületéhez való kötődése miatt a fehérje információ megváltozik és a katalízis szempontjából kedvezőtlenné válik.

c) Az inhibitor nem kötődik sem a katalitikus, sem a kötőhelyhez, és nem befolyásolja a fehérje konformációját. Azonban lokálisan megváltoztathatja a töltéseloszlást a fehérje felületének egy régiójában. Az aktivitás gátlása ebben az esetben is előfordulhat, ha például az aktivitás megnyilvánulásához nélkülözhetetlen csoportok ionizációja lehetetlenné válik, vagy éppen ellenkezőleg, a csak nem ionizált formában aktív csoportok ionizációja következik be. Ez a jelenség főleg erősen savas vagy erősen lúgos reagensek használatakor figyelhető meg.

Az inhibitor és a szubsztrát nem befolyásolja egymás enzimhez való kötődését, de az inhibitort tartalmazó enzimkomplexek teljesen inaktívak. Ebben az esetben a következő elemi szakaszokat feltételezhetjük:

v i / V = ​​​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Ha [I] = K I, az egyenesek meredeksége és a függőleges tengellyel való metszéspont ordinátája megduplázódik 1/v 0-hoz képest.

A nem kompetitív inhibitorok például a cianidok, amelyek erősen kötődnek a vashoz, amely a hemin enzim – a citokróm-oxidáz – katalitikus helyének része. Ennek az enzimnek a blokkolása kikapcsolja a légzőláncot, és a sejt elpusztul. A nem kompetitív enzimgátlók közé tartoznak a nehézfém-ionok és azok szerves vegyületei. Ezért a higany, ólom, kadmium, arzén és mások nehézfém-ionjai nagyon mérgezőek. Ezek blokkolják például az enzim katalitikus helyén található SH-csoportokat.

A nem kompetitív inhibitorok a cianidok, amelyek szorosan kötődnek a vashoz, amely a hemin enzim - citokróm-oxidáz - katalitikus helyének része. Ennek az enzimnek a blokkolása kikapcsolja a légzőláncot, és a sejt elpusztul. A nem kompetitív inhibitor hatását túl sok szubsztrátummal nem lehet eltávolítani (mint a kompetitív hatását), de csak olyan anyagokkal, amelyek megkötik az inhibitort - reaktivátorok.

A nem kompetitív inhibitorokat farmakológiai szerekként, mérgező anyagokként használják mezőgazdasági kártevők elleni védekezésre és katonai célokra. Az orvostudományban higanyt, arzént és bizmutot tartalmazó gyógyszereket használnak, amelyek nem kompetitív módon gátolják a szervezet sejtjeiben lévő enzimeket vagy a kórokozó baktériumokat, ami meghatározza ezek hatását. Mérgezés során reaktivátorok segítségével lehetséges a méreg megkötése vagy kiszorítása az enzim-inhibitor komplexből. Ide tartozik az összes SH tartalmú komplexon (cisztein, dimerkaptopropanol), citromsav, etilén-diamin-tetraecetsav stb.

Nem kompetitív gátlás

Ezt a fajta gátlást versenyellenesnek is nevezik a szakirodalom. vagy kapcsolódó gátlás , azonban a nem kompetitív gátlás kifejezés a legszélesebb körben használt. Az ilyen típusú gátlás jellemzője, hogy az inhibitor nem tud kötődni az enzimhez, de kötődik az enzim-szubsztrát komplexhez.

Nem kompetitív gátlás esetén az inhibitort tartalmazó komplex inaktív:

v i / V = ​​​​/ [E]

[E] T = [E] + +

/ v i = K s / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Szubsztrát gátlás

A szubsztrátgátlás a szubsztrátfelesleg által okozott enzimatikus reakció gátlása. Ez a gátlás egy olyan enzim-szubsztrát komplex képződése miatt következik be, amely nem képes katalitikus átalakulásra, az ES 2 komplex inproduktív és inaktívvá teszi az enzimmolekulát. A szubsztrát gátlást a szubsztrát felesleg okozza, ezért enyhül, ha koncentrációja csökken.

Alloszterikus gátlás

Az alloszterikus szabályozás csak a kvaterner szerkezetű enzimek egy speciális csoportjára jellemző, amelyek szabályozó központokkal rendelkeznek az alloszterikus effektorok megkötésére. A negatív effektorok, amelyek gátolják a szubsztrát átalakulását az enzim aktív helyén, alloszterikus inhibitorként hatnak. A pozitív alloszterikus effektorok éppen ellenkezőleg, felgyorsítják az enzimreakciót, ezért az alloszterikus aktivátorok közé sorolják őket. Az enzimek alloszterikus effektorai leggyakrabban különféle metabolitok, valamint hormonok, fémionok és koenzimek. Ritka esetekben az enzimek alloszterikus effektorának szerepét a szubsztrát molekulák töltik be.

Az alloszterikus inhibitorok enzimre gyakorolt ​​hatásmechanizmusa az aktív centrum konformációjának megváltoztatása. Az enzimreakció sebességének csökkenése vagy a K m növekedésének a következménye, vagy a maximális V max sebesség csökkenésének eredménye a szubsztrát azonos telítési koncentrációinál, pl. az enzim részben tétlen.

Az alloszterikus enzimek abban különböznek a többi enzimtől, hogy speciális S-alakú görbéjük van a reakciósebesség és a szubsztrát koncentráció függvényében. Ez a görbe hasonló a hemoglobin oxigénszaturáció görbéjéhez, azt jelzi, hogy az alegységek aktív centrumai nem autonóm módon, hanem kooperatívan működnek, azaz. minden egyes következő aktív centrum affinitását a szubsztráthoz az előző centrumok telítettségi foka határozza meg. A központok összehangolt munkáját alloszterikus effektorok határozzák meg.

Az alloszterikus szabályozás a lánc első enzimének végterméke általi gátlás formájában nyilvánul meg. A végtermék szerkezete a kiindulási anyag (szubsztrát) sorozatos átalakulása után nem hasonlít a szubsztráthoz, ezért a végtermék csak allosztérikus inhibitorként (effektorként) tud hatni a lánc kiindulási enzimére. Külsőleg az ilyen szabályozás hasonló a visszacsatolási mechanizmus általi szabályozáshoz, és lehetővé teszi a végtermék hozamának szabályozását, amelynek felhalmozódása esetén a lánc első enzimének munkája leáll. Például az aszpartát-karbamoil-transzferáz (ACTase) katalizálja az első hat reakció közül a citidin-trifoszfát (CTP) szintézisében. A CTP az AKTase alloszterikus inhibitora. Ezért, amikor a CTP felhalmozódik, az AKTase gátolt, és a további CTP szintézis leáll. Felfedezték az enzimek hormonok általi alloszterikus szabályozását. Például az ösztrogének a glutamát-dehidrogenáz enzim alloszterikus inhibitorai, amely a glutaminsav dezaminációját katalizálja.

Így az enzimreakció legegyszerűbb kinetikai egyenlete is több kinetikai paramétert tartalmaz, amelyek mindegyike a reakció hőmérsékletétől és környezetétől függ.

Az inhibitorok segítségével nemcsak az enzimatikus katalízis lényegét értjük meg, hanem egyedülálló eszközt jelentenek az egyes kémiai reakciók szerepének tanulmányozására is, amelyek egy adott enzim inhibitorával specifikusan kikapcsolhatók.

3. Néhány eszköz, amely alkalmas a kezdeti reakciósebesség meghatározására

Számos enzimkinetikai probléma vezet a kezdeti reakciósebességek (v 0) meghatározásához. Ennek a módszernek az a fő előnye, hogy a kezdeti időpontban meghatározott v 0 értékek adják a legpontosabban a vizsgált enzimek aktivitását, mivel a felhalmozódó reakciótermékeknek még nincs idejük kifejteni a hatást. gátló hatást gyakorol az enzimre, és emellett a reagáló rendszer stacionárius egyensúlyi állapotban van.

A laboratóriumi gyakorlatban azonban, ha hagyományos spektrofotometriás, titrimetriás vagy egyéb technikákat alkalmaznak az ilyen reakciók lefolyásának rögzítésére, a kezdeti időponttól számítva legfeljebb 15-20 idő vész el az enzimnek a szubsztráthoz való hozzáadásához, a reagáló rendszer keveréséhez, telepítéséhez. a sejt stb. És ez elfogadhatatlan, mivel az érintő ebben az esetben arra a pontra van hozva, ahol tan ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без az állandó keverést tovább bonyolítja a reagensek térfogat szerinti koncentrációjának ingadozása.

Az alábbiakban spektrofotométerhez, pH-mérőhöz és hasonlókhoz javasolt egyszerű eszközök jelentősen csökkenthetik a jelzett hibák forrását a v 0 meghatározásánál.

3.1 Eszköz a spektrofotométerhez

A spektrofotométer egy 1 adagolóból, egy 2 forgó teflonszálból (keverő) és egy 3 reteszelő fedélből áll.

Az adagoló egy mikropipetta, melynek egyik vége 4 tűvel, másik 5 szélesítővel van formázva (hogy az enzim ne kerüljön a 6 gumicsúcsba).

A 7 spektrális cellát fedő 3 teflon burkolatban két lyuk van: az egyik (8) a burkolat közepén, a második (9) a 7 cella átlátszatlan fala és a fény közötti rés közepe felett. gerenda 10. Teflon cső 11 (belső átmérője 1 -1,5 mm) az egyik vége a 9 lyukba van rögzítve, a másik - egy rögzített 12 kiemelkedésen a motor forgórésze 13 előtt. A 2 teflon menetet behelyezzük a csőbe (menet vastagsága 0,5 -0,6 mm). A menet egyik vége a 13 motor forgó rotorjára van rögzítve, a második - a 7 küvettába vezetve - spirál alakú (a keveredés fokozása érdekében). A menet helyzetét a 3 reteszelőfedél határozza meg, függetlenül a motor eltávolításától, ami kényelmes a küvetták gyakori cseréjét igénylő munkákhoz.

Működés elve. A 7 spektrofotométer kvarc küvettája a 14 szubsztrátummal van megtöltve (kb. 1,5-2,0 ml), amelyet a spektrofotométer termosztatikus küvettatartójába helyezünk, fedéllel 3 zárjuk le, forgó teflonszállal 2, amely a 14 szubsztrátumba merül, és minden további műveletet a spektrofotométer fénysugarában hajtanak végre, és rögzítik a rögzítőn.

A munka elején a hordozót összekeverik, és a felvevő toll egyenletes vízszintes (vagy „nulla”) vonalat ír. Az adagolót (enzimmel együtt) a 8. lyukba helyezzük (a tűt a 14 szubsztrát oldatba merítjük), a 6 csúcs gyors összenyomásával az enzimet (általában kb. 0,03-0,05 ml) bevezetjük a hordozóba, és az adagolót eltávolították. A komponensek összekeverése 2,5-3 s alatt véget ér, és a felvevő toll az optikai sűrűség (ΔA) görbe időbeli eltérésével rögzíti a reakció kezdetét.

Ez az eszköz lehetővé teszi a reagáló rendszerből minták vételét elemzés céljából; inhibitorokat és aktivátorokat adjon a rendszerhez; a reakciókörülmények megváltoztatása (pH, ionerősség stb. módosítása) anélkül, hogy megzavarná a reakció előrehaladásának rögzítését, ami nagyon kényelmesnek bizonyul például a hasadás vizsgálatakor n-NPF „savas” foszfatázok által, ahol a hasítás n-NFF pH 5,0 (vagy pH 6-7) történik, és az enzimaktivitást a felhalmozódás határozza meg n-nitro-fenolát ionok 9,5-10,0 pH-n.

Egy ilyen eszköz alkalmas enzimek spektrofotometriás titrálására stb.

3.2 Készülék pH-mérőhöz

A pH-mérő eszköze az 1 áramlási elektróda módosított csúcsából, egy 2 félmikrocellából, egy 3 adagolóból és egy elektronikus áramkörből áll, amely a pH-mérőt a rögzítőhöz csatlakoztatja. Ezenkívül a készülék tartalmaz egy szabványos pH-mérő elektródát (4), egy cellatartó fedelet (5), egy termosztatikus áramlási kamrát (6), egy hordozóoldatot (7), egy passzív mágnest (8) és egy aktív mágnest ( 9).

A pH-mérő (LPU-01) áramlási elektródájának szabványos csúcsát 1-es tefloncsőre (belső átmérő 1,3-1,5 mm) cseréljük, és azbesztszállal töltjük meg, telített KCl-oldattal előkezeljük. A menettöltési sűrűséget úgy állítjuk be, hogy a KCl oldat áramlási sebessége a csövön közel legyen az eredeti, módosítatlan elektróda áramlási sebességéhez. Ez a csúcscsere lehetővé teszi a kezdeti munkacella méretének 20-25-ről 2 ml-re történő csökkentését, ami lehetővé teszi a drága biokémiai gyógyszerek minimális térfogatú (1,5 ml) oldatának felhasználását.

A pH-mérőt (LPU-01) a rögzítőhöz csatlakoztató elektronikus áramkör egy áramforrásból (12 V DC akkumulátor), egy R 1 (10-100 Ohm) váltakozó vezetékellenállásból áll, amely 9 V feszültséget állít be a készüléken. D809 zener dióda a voltmérő leolvasása szerint, váltakozó vezetékellenállás R 2 (15-150 Ohm), amely szabályozza a pH-mérő leolvasásának „nulla” (referenciapont) beállítását a rögzítő skálán, és változtatható vezetékellenállás R 3 (35-500 Ohm), amely szabályozza a pH skála tágulási (erősítési) skáláját - mérők a felvevőn. Az áramkör megbízhatóan működik, amíg a forrásfeszültség 9 V alá nem csökken.

Működés elve. 1,5 ml szubsztrátot adunk a cellához (1,7x2,4 cm-es üveghenger), és a cellát a zárófedélre rögzítjük 5. Bekapcsoljuk a keverést 9, és a rögzítő toll egyenletes (alap) referenciavonalat ír. Egy adagoló segítségével 0,03 ml enzimoldatot adunk a szubsztráthoz, és a felvevő toll a pH-idő (t) görbe eltérésével rögzíti a reakció kezdetét.

Egy ilyen eszköz nem helyettesíti a pH-statisztikát, de figyelembe véve a pH-mérő skála bővítésének lehetőségét, lehetővé teszi a 0,004-0,005 pH-érték kisebb változásainak megbízható rögzítését.

3.3 Nomogram vonalzók, kényelmesek a kezdeti sebesség meghatározásához

Jelentős bonyolultságot jelent a kezdősebesség tangens módszerrel történő meghatározásakor a reagensek koncentrációinak (Δ[S]) időegységenkénti (Δt) változásának arányának kiszámítása, azaz a t. v 0 kifejezés M/percben azokból a feltételekből, amelyek

v 0 = lim Δ[S] / Δt, t 0-nál.

A gyakorlatban egy ilyen eljárás általában három-négy különálló műveletből áll: a reakció előrehaladási görbe kezdeti szakaszára egy érintőt húzunk, majd a rögzített érték egységeinek számát (optikai sűrűség, forgásszög stb.) perenként. egy bizonyos időintervallumot számolunk, és ezt az időegységre állítjuk be, és végül újraszámoljuk a rögzítő leolvasásait a reagenskoncentrációk 1 perc alatti változására (M/perc). A javasolt kétféle nomogram vonalzó lehetővé teszi ennek az eljárásnak az egyszerűsítését.

Téglalap alakú vonalzó. v 0 a Δ[S]/Δt arány, azaz. tg ά, ahol ά a t időtengely érintőjének dőlésszöge. Ugyanez az érintő a megfelelő derékszögű háromszög befogója is [S] lábakkal és vele. Minél nagyobb v 0, annál meredekebb az érintő lejtése. Következésképpen, ha egy bizonyos időintervallumra korlátozzuk magunkat, például 1 percre, akkor egy sor derékszögű háromszöget kapunk a láb [S] különböző értékeivel (a valóságban különböző v 0 értékekkel). Ha mindkét lábat kalibrálja: vízszintes - időegységben (1 perc), és függőleges - a reagenskoncentráció változásának mértékegységében, például millimolban (mM), és a kapott szegmenseket átlátszó anyagból (plexiből) készült megfelelő formátumra alkalmazza. körülbelül 2 mm vastagságú), akkor beszerezhet egy kényelmes vonalzót a kezdeti reakciósebességek meghatározásához. Az összes szám és vonal a vonalzó hátoldalán található, hogy kiküszöbölje a parallaxis hibákat v 0 meghatározásakor.

A v 0 meghatározására szolgáló eljárás ebben az esetben két egyszerű műveletre redukálódik: egy érintőt húzunk a t kinetikai görbe kezdeti szakaszára. 2 és a vonalzó t vízszintes lábának nullpontját kombináljuk az érintő kezdetével, az érintő folytatása ekkor metszi a koncentrációs skálát [S] abban a pontban, amely meghatározza a v 0 értéket M/percben (a a láb vízszintes helyzete t be Nincs szükség további műveletekre.

Ívvonalzó. A v 0 meghatározásának eljárása leegyszerűsíthető egy műveletre, ha a koncentrációs skálát egy bizonyos sugarú ív mentén ábrázoljuk.

Egy átlátszó anyagból készült lemezre egy egyenes („alap”) vonalat 2 helyezünk (a vonalzó hátoldalán is minden szám és vonal van), és ennek a vonalnak a nullapontjától (t=0, min) egy sugár megegyezik a láb hosszával t=1 min [ , rajzoljon egy ívet [S] fentről lefelé, amelyen a reagens koncentrációjának változásai (például a szubsztrát mM-ban) láthatók.

A leírt vonalzótípusokat, spektrofotométer készüléket és pH-mérőt évek óta alkalmazzák a reakciók kezdeti sebességének (v 0) meghatározására, az enzimek szubsztrátspecifitásának vizsgálatára, spektrofotometriás titrálásra stb.

Következtetés

Ez a munka az enzimológia azon ágát vizsgálta, amely az enzimek által katalizált kémiai reakciók sebességének számos környezeti tényezőtől való függését vizsgálja. E tudomány alapítói joggal Michaelisnek és Mentennek tekinthetők, akik közzétették elméletüket az általános mechanizmusról Az enzimreakciók során olyan egyenletet vezettek le, amely az enzimek minden kinetikai vizsgálatának alapelvévé vált, és ez szolgál kiindulópontul az enzimek hatásának kvantitatív leírásához. Az eredeti Michaelis-Menten egyenlet egy hiperbola egyenlet; Lineweaver és Burke hozzájárult a kinetikához, akik átalakították a Michaelis-Menten egyenletet, és egy olyan egyenes grafikonját kapták, amelyből a V max értéke a legpontosabban meghatározható.

Idővel az enzimes reakció sebességének változása az enzimes reakcióban kísérleti körülmények között csökken. A sebesség csökkenése számos tényező hatására következhet be: a szubsztrátum koncentrációjának csökkenése, a termék koncentrációjának növekedése, ami gátló hatású lehet, az oldat pH-értékének változása, a hőmérséklet változása előfordulhat. Tehát minden 10°C-os hőmérséklet-emelkedéssel a reakciósebesség 2-szeresére vagy még kevesebbre nő. Az alacsony hőmérséklet reverzibilisen inaktiválja az enzimeket. Az enzimreakció sebességének a pH-tól való függése az enzim aktív centrumának funkciós csoportjainak állapotát jelzi. Mindegyik enzim másképp reagál a pH változásaira. A kémiai reakciók különböző típusú gátlásokkal megállíthatók. A kezdeti reakciósebesség gyorsan és pontosan meghatározható olyan eszközökkel, mint a nomogram vonalzók, egy spektrofotométer készülék és egy pH-mérő. Ez lehetővé teszi a vizsgált enzimek aktivitásának legpontosabb ábrázolását.

Mindezt ma aktívan használják az orvosi gyakorlatban.

A felhasznált források listája

1. Belyasova N.A. Biokémia és molekuláris biológia. - Mn.: könyvesház, 2004. - 416 p., ill.

Keleti T. Az enzimkinetika alapjai: Transz. angolról - M.: Mir, 1990. -350 p., ill.

3. Knorre DG. Biológiai kémia: Tankönyv. kémiára, biol. és méz szakember. egyetemek - 3. kiadás, rev. - M.: Feljebb. iskola 2002. - 479 p.: ill.

4. Krupyanenko V.I. Vektoros módszer enzimatikus reakciók ábrázolására. - M.: Nauka, 1990. - 144 p.

5. Leninger A. Biokémia. A sejtszerkezet és működés molekuláris alapja: Transz. angolról - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Biológiai kémia: Gyógyszertankönyv. Institute and Pharmac. fak. édesem. Inst. - M.: Felsőiskola, 1986. - 479 p., ill.

Severin E.S. Biokémia. A. - 5. kiadás - M.: GEOTAR - Média, 2009. - 786 p., ill.

ENZIMATÍV REAKCIÓKINETIKA

tanulmányozza az enzimatikus reakciók időbeli lefutásának mintázatait, valamint azok mechanizmusát; fejezet kémiai kinetika.

Katalitikus az S anyag (szubsztrát) P termékké való átalakulásának ciklusa az E enzim hatására az intermedierek képződésével folytatódik. konn. x én:

Ahol ki- az egyes elemi fokozatok sebességi állandói, az X 1 enzim-szubsztrát komplex képződése (ES, Michaelis komplex).

Adott hőmérsékleten a reakció sebessége az enzim koncentrációjától, a szubsztráttól és a közeg összetételétől függ. Az enzimatikus reakcióknak van stacionárius, prestacionárius és relaxációs kinetikája.

Stacionárius kinetika.Álló állapotban köztes csatlakozásokon keresztül. (dX én/dt= 0, i = 1, ..., n) és szubsztrát felesleggel, ahol [S] 0 és [E] 0 a kezdeti koncentrációk. szubsztrát és enzim, a folyamat kinetikáját állandó, időben invariáns koncentrációszint jellemzi. conn., és a folyamat sebességének kifejezése v 0, hívott kezdeti állósebesség, a következő formában van (Michaelis-Menten egyenlet):

(1)

ahol a k kat és K m -> elemi fokozatok sebességi állandóinak függvényei, és az egyenletek adják meg:

A k értéke kat hívott hatékony katalizátor folyamat sebesség állandó, paraméter K m -> Michaelis állandó. k macska érték mennyiségek határozzák meg max. a katalitikus lassú szakaszai kerületek és néha hívják az enzim fordulatszáma (enzimrendszer); k kat a katalizátorok számát jellemzi az enzimrendszer által egységnyi idő alatt végrehajtott ciklusok. Naib. gyakori, amelynek értéke k kat. konkrét hordozók a 10 2 -10 3 s -1 tartományban. A Michaelis-állandó tipikus értékei a 10 -3 - 10 -4 M tartományban vannak.

A szubsztrátum nagy koncentrációinál, amikor, azaz a keringés sebessége nem függ a szubsztrát koncentrációjától, és elér egy állandó értéket, ún. Max. sebesség. Grafikailag a Michaelis-Menten egyenlet egy hiperbola. Linearizálható a kettős reciprok módszerével (Linewere-Burk módszer), azaz az 1/v függőség 1/[S] 0-ról való megkonstruálásával, vagy más módszerekkel. Az (1) egyenlet lineáris alakja a következő:

(2)

Lehetővé teszi az értékek grafikus meghatározását K més v max (1. ábra).

Rizs. 1. A Michaelis - Menten egyenlet lineáris transzformációjának grafikonja kettős reciprokban (Lineweaver - Burke szerint).

Nagyságrend K m > számszerűen egyenlő a szubsztrát koncentrációjával, amelynél a keringés sebessége egyenlő, ezért K m gyakran a szubsztrát és az enzim affinitásának mértékeként szolgál, de ez csak akkor érvényes, ha

Mennyiségek K m >És pH-értékeitől függően változhat. Ez annak köszönhető, hogy a katalízisben részt vevő enzimmolekula-csoportok képesek megváltoztatni ionizációs állapotukat és ezáltal katalitikus aktivitásukat. hatékonyság. A pH változása legegyszerűbb esetben a katalízisben részt vevő enzim legalább két ionizálható csoportjának protonálódását vagy deprotonálódását eredményezi. Ha ebben az esetben a három lehetséges formából (ES, ESH és ESH 2) az enzim-szubsztrát komplexnek csak egy formája (például ESH) alakulhat át az oldat termékévé, akkor az a pH-értéket a következő képlet írja le:

Ahol f = 1 + / És f" = 1 + +K" b />-T. hívott Michaelis pH-függvényei, és K a, K bÉs K" a, K" b -> az a és a brsp. csoport ionizációs állandói. ingyenes enzim és enzim-szubsztrát komplex. lg koordinátákkal - pH Ezt a függést az ábra mutatja be. 2, és a görbe emelkedő, pH-tól független, csökkenő ágának érintőinek dőlésszögeinek érintőinek +1, 0 és -1 kell lenniük. Egy ilyen grafikonból meghatározhatja az értékeket pK a katalízisben részt vevő csoportok.

Rizs. 2. A katalizátor függősége állandók pH-tól logaritmikusig. koordináták

Az enzimreakció sebessége nem mindig engedelmeskedik az (1) egyenletnek. Az egyik leggyakoribb eset az alloszterikus részvétel a reakcióban. enzimek (lásd enzimszabályozók), amelyeknél az enzim telítettségi fokának [S] 0-tól való függése nem hiperbolikus. karakter (3. ábra). Ez a jelenség a szubsztrátkötés kooperativitásának köszönhető, vagyis amikor egy szubsztrát kötődése az enzim makromolekula egyik helyén növeli (pozitív kooperativitás) vagy csökkenti (negatív kooperativitás) egy másik hely szubsztrátjához való affinitását.

Rizs. H Az enzim szubsztráttal való telítési fokának függősége a pozitív (I) és negatív (II) kooperativitású szubsztrát koncentrációjától, valamint annak hiányában (III).

Az egyensúlyi állapot előtti kinetika. Az enzim és szubsztrát oldatok gyors, 10 -6 -10 -1 s időintervallumban történő összekeverésével átmeneti folyamatok figyelhetők meg, amelyek megelőzik a stabil stacionárius állapot kialakulását. Ebben a prestacionárius üzemmódban, ha nagy mennyiségű hordozót használunk, a differenciálrendszer. A folyamatok kinetikáját leíró egyenlet lineáris. Az ilyen típusú lineáris differenciálrendszer megoldása. Az egyenletet az exponenciális tagok összege adja. Tehát a kinetika miatt A fent bemutatott séma szerint a termékfelhalmozódás kinetikája a következőképpen alakul:

hol egy én ->, b és n -> elemi sebességi állandók függvényei; -a megfelelő jellemző gyökerei. szint.

A reciprok mennyiséget ún jellegzetes feldolgozási idő:

Egy nintervallum részvételével folyó folyóhoz. kapcsolathoz kaphat njellemzőket. alkalommal

Az enzimreakció kinetikájának prestacionárius módban történő tanulmányozása lehetővé teszi, hogy képet kapjunk a katalitikus reakciók részletes mechanizmusáról. ciklust, és határozza meg a folyamat elemi szakaszainak sebességi állandóit.

Kísérletileg az enzimatikus reakció kinetikáját prestacionárius módban a stop jet módszerrel tanulmányozzuk (lásd. Jet kinetikai módszerek), lehetővé teszi az oldat komponenseinek 1 ms-on belüli összekeverését.

Relaxációs kinetika. A rendszert érő gyors zavaró hatás (hőmérséklet, nyomás, elektromos tér változása) mellett a katalitikus reakciót meghatározó folyamatok sebességétől függ, hogy mennyi idő szükséges ahhoz, hogy a rendszer új egyensúlyi vagy stacionárius állapotot érjen el. enzimatikus ciklus.

A folyamat kinetikáját leíró egyenletrendszer lineáris, ha az egyensúlyi helyzetből való elmozdulás kicsi. A rendszer megoldása a komponensek koncentrációinak függőségéhez vezet, dec. a folyamat szakaszai exponenciális tagok összege formájában, amelyek exponensei relaxációs idők jellegűek. A vizsgálat eredménye az intervallumok számának megfelelő relaxációs idők spektruma. a folyamatban részt vevő kapcsolatok. A relaxációs idők a folyamatok elemi szakaszainak sebességi állandóitól függenek.

Relaxációs technikák A kinetika lehetővé teszi az intermedierek átalakulásának egyes elemi szakaszai sebességi állandóinak meghatározását. A relaxációs kinetika tanulmányozásának módszerei eltérőek. felbontás: ultrahang abszorpció - 10 -6 -10 -10 s, hőmérséklet ugrás - 1O -4 -10 -6 s, elektromos módszer. impulzus - 10 -4 -10 -6 s, nyomásugrás - 10 -2 s. Az enzimatikus reakciók kinetikájának tanulmányozása során a hőmérsékletugrás módszere talált alkalmazásra.

Enzimatikus folyamatok makrokinetikája. Eljárások kidolgozása heterogén katalizátorok előállítására enzimek bomlás közbeni immobilizálásával. média (lásd Immobilizált enzimek) szükségessé tette a folyamatok kinetikájának elemzését, figyelembe véve a szubsztrát tömegátadását. A reakciók kinetikáját elméletileg és kísérletileg tanulmányozták, figyelembe véve a diffúziós réteg hatását, valamint olyan rendszerek esetében, amelyek intradiffúziós nehézségekkel küzdenek az enzim hordozón belüli eloszlása ​​során.

Olyan körülmények között, ahol a folyamat kinetikáját befolyásolja a szubsztrát diffúziós átvitele, katalitikus. csökken a rendszer hatékonysága. A hatékonysági tényező egyenlő a termék áramlási sűrűségének diffúziósan csökkentett szubsztrátkoncentrációjú enzimatikus áramlási körülmények között a diffúziós korlátozások hiányában megvalósítható áramláshoz viszonyított arányával. A tisztán diffúziós tartományban, amikor a folyamat sebességét a szubsztrát tömegátadása határozza meg, a külső diffúziógátlásos rendszerek hatékonysági tényezője fordítottan arányos a diffúziós modulussal:

Ahol a diffúziós réteg vastagsága, D - együttható. szubsztrát diffúzió.

Elsőrendű régiókban intradiffúziós gátlású rendszerekhez

ahol Ф T- dimenzió nélküli modulus (Thiele modulus).

A kinetika elemzésekor Az enzimatikus reaktorok mintái széles körben elméletiek. és kísérletezzen. „ideális” reaktormodelleket fejlesztettek ki: áramlásos reaktor (ideális keveréssel működő áramlási reaktor), ideális kiszorítású áramlásos reaktor és membránreaktor.

Multienzimes folyamatok kinetikája. A szervezetben (sejtben) az enzimek nem elszigetelten hatnak, hanem a molekulák átalakulási láncait katalizálják. R-ionok multienzimes rendszerekben kinetikával. álláspontja következetesnek tekinthető. folyamatok, specifikus Ennek egyik jellemzője az egyes szakaszok enzimjei:

Ahol , ill. max, feldolgozási sebesség és Michaelis állandó én kerületi szakaszának, ill.

A folyamat fontos jellemzője a stabil álló állapot kialakításának lehetősége. Előfordulásának feltétele az egyenlőtlenség lehet > v 0 , ahol v 0 a határoló fokozat sebessége, amelyet a legkisebb sebességi állandóval jellemez, és ezáltal meghatározza minden következő lépés sebességét. folyamat. Egyensúlyi állapotban a metabolitok koncentrációja a limitáló szakasz után kisebb, mint a megfelelő enzim Michaelis-állandója.

Különleges a multienzimes rendszerek csoportját az oxidáció-redukciót végző rendszerek alkotják. r-ionok fehérje elektronhordozók részvételével. A hordozók formája specifikus szerkezetek, komplexek az elektronátvitel determinisztikus sorozatával. Kinetikus. az ilyen típusú rendszerek leírása a dekompozíciós áramkörök állapotát független változónak tekinti. elektronpopuláció foka.

Alkalmazás. F.r. A K.-t széles körben használják a kutatási gyakorlatban enzimek és enzimrendszerek hatásmechanizmusainak tanulmányozására. Az enzimtudomány gyakorlatilag jelentős területe az mérnöki enzimológia, F. r fogalmaival operál. a biotechnológia optimalizálására. folyamatokat.

Megvilágított.: Poltorak O. M., Chukhrai E. S., Physico-chemical Foundations of Enzymatic catalysis, M., 1971; Berezin I.V., Martinek K., Az enzimatikus katalízis fizikai kémiájának alapjai, M., 1977; Varfolomeev S. D., Zaitsev S. V., Kinetikai módszerek a biokémiai kutatásban, M.. 1982. S. D. Varfolomeev.

Kémiai enciklopédia. - M.: Szovjet Enciklopédia. Szerk. I. L. Knunyants. 1988 .

Nézze meg, mi az "ENZIMATÍV REAKCIÓKINETICS" más szótárakban:

Katalitikus rádió ciklikus számos elemi mozgásból álló folyamat, amelyek sebességét a tömeghatás törvénye írja le. Ennek a törvénynek egyszerű formája van ideális gázkeverékekre, ideális folyadékokra és ideális felületi rétegekre... Kémiai enciklopédia

A kémiai reakciók kinetikája, a kémiai folyamatok tanulmányozása, bekövetkezésük törvényszerűségei időben, sebességben és mechanizmusban. A modern kémia és kémiai tudomány legfontosabb területei a kémiai reakciók kinetikájának vizsgálataihoz kötődnek... ... Nagy Szovjet Enciklopédia

KÉMIAI KINETIKA- (a görög kinesis mozgalomból), az elméleti kémia tanszéke, amely a kémia törvényeinek tanulmányozásával foglalkozik. reakciók. Többféle vegyszert lehet azonosítani. kölcsönhatások, és mindenekelőtt a homogén (homogén) közegben végbemenő reakciók megkülönböztetése a reakcióktól... ... Nagy Orvosi Enciklopédia

- (biokatalízis), a biokémiai gyorsítás. fehérje makromolekulák, úgynevezett enzimek részvételével. Az F. k. a katalízis egy fajtája, bár az erjesztés (fermentáció) kifejezést ősidők óta ismerték, amikor még nem létezett a kémia fogalma. katalízis. Első… … Kémiai enciklopédia

- (a latin re előtagból fordított cselekvés, és actio cselekvés), egyesek átalakulása (kezdeti vegyületek) másokká (az étrend termékeivé) az atommagok megváltoztathatatlanságával (szemben a magreakciókkal). Kezdeti vegyületek R. x. néha úgy hívják...... Kémiai enciklopédia

- (a latin fermentum starter szóból) (enzimek), fehérjék, amelyek katalizátorként működnek az élő szervezetekben. Alapvető F. funkciói a szervezetbe kerülő és az anyagcsere során keletkező anyagok átalakulásának felgyorsítására (sejtszerkezetek megújítására, annak ... Kémiai enciklopédia

- (a görög pharmakon medicina és kinetikos szóból mozgásba hoz), kinetikát tanul. lekkel előforduló folyamatok mintázatai. Wed vom a testben. Alapvető farmakokinetikai folyamatok: felszívódás, eloszlás, anyagcsere és kiválasztás (eltávolítás).... Kémiai enciklopédia

A reakciósebesség enzimkoncentrációtól és szubsztrátkoncentrációtól való függését (enzimatikus reakciók kinetikáját) a grafikonok mutatják be.

ütemterv 1 ütemterv 2

Egy enzimes reakcióban ( F+S 2 ó 1 FS→ 3 F + P) Három összetevő szakasz sebességét különböztetjük meg:

1- az FS enzim-szubsztrát komplex kialakulása,

2- az enzim-szubsztrát komplex reverz bomlása,

3 – az enzim-szubsztrát komplex bomlása reakciótermékek képződésével. Ezen reakciók mindegyikének sebessége megfelel a tömeghatás törvényének:

V 1 = K 1 [F]* [S]

V 2 = K 2 *

Az egyensúlyi pillanatban az FS képződésének reakciósebessége megegyezik a bomlási sebességek összegével: V 1 = V 2 + V 3. Az enzimreakció három szakasza közül a legfontosabb és leglassabb a harmadik, mivel ez a reakciótermékek képződésével kapcsolatos. A fenti képlet alapján nem lehet meghatározni a V 3 sebességet, mivel az enzim-szubsztrát komplex nagyon instabil, koncentrációjának mérése nehézkes. Ebben a tekintetben Michaelis-Menten bevezette a Km-t - a Michaelis-állandót, és a V 3 mérésére szolgáló egyenletet egy új egyenletté alakította, amelyben valójában mérhető mennyiségek vannak:

V 3 = K 3 * * [S] / Km + [S] vagy V 3 = V max * [S] / Km + [S]

– kezdeti enzimkoncentráció

Km – Michaelis állandó.

Km fizikai jelentése: Km = (K 2 + K 3) / K 1. Megmutatja az enzim-szubsztrát komplex bomlásának sebességi állandóinak és képződésének sebességi állandóinak arányát.

A Michaelis-Menten egyenlet univerzális. A reakciósebesség [S]-től való függését szemlélteti

1. A reakciósebesség függése a szubsztrát koncentrációtól. Ez a függőség alacsony szubsztrátkoncentrációknál mutatkozik meg [S] V 3 = K 3* * [S] / Km. Ebben az egyenletben K 3 , F 0 ], Km –állandók és helyettesíthető egy új K* konstanssal. Így alacsony szubsztrátkoncentrációnál a reakciósebesség egyenesen arányos ezzel a koncentrációval V 3 = K* * [S]. Ez a függőség a 2. grafikon első szakaszának felel meg.

2. A sebesség függése az enzimkoncentrációtól magas szubsztrátkoncentrációnál jelenik meg. S≥Km. Ebben az esetben a Km elhanyagolható, és az egyenlet a következő lesz: V 3 = K 3* (( * [S]) / [S]) = K 3* = V max.Így magas szubsztrátkoncentráció esetén a reakció sebességét az enzimkoncentráció határozza meg, és eléri a maximális értéket V 3 = K 3 = V max.(a 2. grafikon harmadik része).

3. Lehetővé teszi a Km számértékének meghatározását feltéve, hogy V 3 = V max /2. Ebben az esetben az egyenlet a következőképpen alakul:

V max /2 = ((V max *[S])/Km+[S]), ami azt jelenti, hogy Km=[S]

Így a Km számszerűen egyenlő a szubsztrát koncentrációjával a maximum felével egyenlő reakciósebesség mellett. A Km egy enzim nagyon fontos jellemzője, mólokban (10 -2 – 10 -6 mol) mérik, és az enzim specificitását jellemzi: minél kisebb a Km, annál nagyobb az enzim specificitása.

A Michaelis-állandó grafikus definíciója.

Kényelmesebb olyan grafikont használni, amely egy egyenest ábrázol. Egy ilyen gráfot Lineweaver–Burk javasolt (kettős reciprok gráfja), amely megfelel az inverz Michaelis–Menten egyenletnek.

Szinte minden biokémiai reakció enzimatikus. Enzimek(biokatalizátorok) fémkationok által aktivált fehérjeanyagok. Körülbelül 2000 különféle enzim ismeretes, közülük körülbelül 150-et izoláltak, amelyek egy részét gyógyszerként használják. A tripszin és a kimotripszin hörghurut és tüdőgyulladás kezelésére szolgál; pepszin - gyomorhurut kezelésére; plazmin - szívroham kezelésére; Pankreatin – a hasnyálmirigy kezelésére. Az enzimek különböznek a hagyományos katalizátoroktól: (a) nagyobb katalitikus aktivitásukban; (b) nagy specificitású, pl. a cselekvés szelektivitása.

Az egyszubsztrát enzimes reakció mechanizmusa a következő diagrammal ábrázolható:

ahol E egy enzim,

S - hordozó,

ES - enzim-szubsztrát komplex,

P a reakciótermék.

Az enzimreakció első szakaszának jellemzője az Michaelis állandó (K M). K M az egyensúlyi állandó reciproka:

A Michaelis-állandó (K M) az enzim-szubsztrát komplex (ES) stabilitását jellemzi. Minél alacsonyabb a Michaelis-állandó (K M), annál stabilabb a komplex.

Egy enzimreakció sebessége megegyezik a sebességkorlátozó szakasz sebességével:

ahol k 2 a sebességi állandó, ún fordulatok száma vagy az enzim molekuláris aktivitása.

molekuláris enzimaktivitás(k 2) egyenlő azoknak a szubsztrátmolekuláknak a számával, amelyek egy enzimmolekula hatására 1 perc alatt, 25 0 C-on átalakulnak. Ez az állandó értéke a következő tartományba esik: 1·10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Az ureáz esetében, amely felgyorsítja a karbamid hidrolízisét, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; az adenozin-trifoszfatáz esetében, amely felgyorsítja az ATP hidrolízisét, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; a H ​​2 O 2 bomlását felgyorsító kataláz esetében k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

Az enzimatikus reakció kinetikai egyenlete azonban a fent megadott formában gyakorlatilag nem használható, mivel nem lehet kísérletileg meghatározni az enzim-szubsztrát komplex koncentrációját (). Más mennyiségekkel kifejezve, amelyek kísérletileg könnyen meghatározhatók, megkapjuk az enzimreakciók kinetikai egyenletét, hívott a Michaelis-Menten egyenlet alapján (1913):

,

ahol a k 2 [E] összszorzat egy állandó érték, amelyet jelölünk (maximális sebesség).

Illetőleg:

Tekintsük a Michaelis-Menten egyenlet speciális eseteit.

1) Alacsony szubsztrátkoncentrációnál K M >> [S] tehát

amely megfelel az elsőrendű reakció kinetikai egyenletének.

2) Magas szubsztrátkoncentrációnál K m<< [S], поэтому

amely megfelel a nulladrendű reakció kinetikai egyenletének.

Így alacsony szubsztrátkoncentráció mellett az enzimreakció sebessége a rendszer szubsztráttartalmának növekedésével növekszik, magas szubsztrátkoncentrációnál pedig a kinetikai görbe elér egy platót (a reakciósebesség nem függ a szubsztrát koncentrációjától) 30).

30. ábra - Egy enzimreakció kinetikai görbéje

Ha [S] = K M, akkor

amely lehetővé teszi a K m Michaelis-állandó grafikus meghatározását (31. ábra).

31. ábra - A Michaelis-állandó grafikus definíciója

Az enzimek aktivitását befolyásolja: (a) hőmérséklet, (b) a tápközeg savassága, (c) inhibitorok jelenléte. A hőmérséklet hatását az enzimreakció sebességére a 9.3. fejezet tárgyalja.

A közeg savasságának hatását az enzimreakció sebességére a 32. ábra mutatja be. A maximális enzimaktivitás megfelel az optimális pH-értéknek (pH opt).

32. ábra - Az oldat savasságának hatása az enzimaktivitásra

A legtöbb enzim esetében az optimális pH-értékek egybeesnek a fiziológiás értékekkel (7,3-7,4). Vannak azonban olyan enzimek, amelyek normális működéséhez erősen savas (pepszin - 1,5 - 2,5) vagy kellően lúgos (argináz - 9,5 - 9,9) környezet szükséges.

Enzim inhibitorok- ezek olyan anyagok, amelyek az enzimmolekulák aktív központjainak egy részét foglalják el, aminek következtében az enzimreakció sebessége csökken. Nehézfémkationok, szerves savak és egyéb vegyületek gátló hatásúak.

11. előadás

Atomszerkezet

Az „atom” fogalmának két definíciója van. Atom a kémiai elem legkisebb részecskéje, amely megőrzi kémiai tulajdonságait.

Atom egy elektromosan semleges mikrorendszer, amely egy pozitív töltésű magból és egy negatív töltésű elektronhéjból áll.

Az atom doktrínája hosszú fejlődési utat járt be. Az atomizmus fejlődésének fő szakaszai a következők:

1) természetfilozófiai szakasz - az anyag atomi szerkezete fogalmának kialakulásának időszaka, amelyet kísérlet nem erősített meg (Kr. e. 5. század - Kr. u. 16. század);

2) az atomról, mint egy kémiai elem legkisebb részecskéjéről szóló hipotézis kialakulásának szakasza (XVIII-XIX. század);

3) olyan fizikai modellek létrehozásának szakasza, amelyek tükrözik az atom szerkezetének összetettségét, és lehetővé teszik tulajdonságainak leírását (a XX. század eleje)

4) az atomizmus modern szakaszát kvantummechanikának nevezik. Kvantummechanika a fizika egyik ága, amely az elemi részecskék mozgását vizsgálja.

TERV

11.1. A mag felépítése. Izotópok.

11.2. Az atom elektronhéjának kvantummechanikai modellje.

11.3. Az atomok fizikai-kémiai jellemzői.

A mag felépítése. Izotópok

Atommag egy pozitív töltésű részecske, amely protonokból, neutronokból és néhány más elemi részecskéből áll.

Általánosan elfogadott, hogy az atommag fő elemi részecskéi a protonok és a neutronok. Proton (p) – Olyan elemi részecske, amelynek relatív atomtömege 1 amu és relatív töltése + 1. Neutron (n) – Ez egy olyan elemi részecske, amelynek nincs elektromos töltése, és tömege megegyezik a proton tömegével.

Az atom tömegének 99,95%-a koncentrálódik az atommagban. Az elemi részecskék között speciális nukleáris kiterjesztési erők vannak, amelyek jelentősen meghaladják az elektrosztatikus taszító erőket.

Az atom alapvető jellemzője az díjövé kernelek, megegyezik a protonok számával, és egybeesik a kémiai elemek periódusos rendszerében szereplő elem rendszámával. Azonos magtöltésű atomok halmazát (típusát) nevezzük kémiai elem. Az 1-től 92-ig terjedő számokkal rendelkező elemek megtalálhatók a természetben.

Izotópok- ezek ugyanannak a kémiai elemnek az atomjai, amelyek az atommagban azonos számú protont és különböző számú neutront tartalmaznak.

ahol a tömegszám (A) az atommag tömege, z az atommag töltése.

Minden kémiai elem izotóp keveréke. Az izotópok neve általában egybeesik a kémiai elem nevével. A hidrogénizotópokra azonban speciális elnevezéseket vezettek be. A hidrogén kémiai elemet három izotóp képviseli:

Szám p Szám n

Protium N 1 0

Deutérium D 1 1

Trícium T 1 2

Egy kémiai elem izotópjai lehetnek stabilak és radioaktívak is. A radioaktív izotópok olyan magokat tartalmaznak, amelyek spontán lebomlanak, részecskéket és energiát szabadítanak fel. Az atommag stabilitását a neutron-proton arány határozza meg.

A szervezetbe jutva a radionuklidok megzavarják a legfontosabb biokémiai folyamatokat, csökkentik az immunitást, és betegségekre ítélik a szervezetet. A szervezet a környezeti elemek szelektív elnyelésével védekezik a sugárzás hatásai ellen. A stabil izotópok elsőbbséget élveznek a radioaktív izotópokkal szemben. Más szóval, a stabil izotópok gátolják a radioaktív izotópok felhalmozódását az élő szervezetekben (8. táblázat).

S. Shannon „Nutrition in the Atomic Age” című könyve a következő adatokat tartalmazza. Ha az I-131 szervezetbe kerülése után legkésőbb 2 órával a stabil jód izotóp ~100 mg-os blokkoló dózisát veszik be, a pajzsmirigy radiojódfelvétele 90%-kal csökken.

A radioizotópokat az orvostudományban használják

bizonyos betegségek diagnosztizálására,

· a rák minden formájának kezelésére,

· patofiziológiai vizsgálatokhoz.

8. táblázat – Stabil izotópok blokkoló hatása

Az enzimkinetika az enzimek által katalizált reakciók sebességét vizsgálja a szubsztráttal való kölcsönhatásuk különböző körülményeitől (koncentráció, hőmérséklet, pH stb.) függően.

Az enzimek azonban olyan fehérjék, amelyek érzékenyek a különféle külső hatásokra. Ezért az enzimreakciók sebességének vizsgálatakor elsősorban a reagáló anyagok koncentrációját veszik figyelembe, és igyekeznek minimalizálni a hőmérséklet, a környezet pH-értékének, az aktivátorok, inhibitorok és egyéb tényezők hatását, és standard feltételeket teremteni. Először is, ez a környezet pH-értéke, amely optimális az adott enzim számára. Másodszor, lehetőség szerint 25°C-os hőmérséklet fenntartása javasolt. Harmadszor, elérjük az enzim teljes telítését a szubsztráttal. Ez a pont azért különösen fontos, mert alacsony szubsztrátkoncentráció esetén nem minden enzimmolekula vesz részt a reakcióban (6.5. ábra, A), ami azt jelenti, hogy az eredmény messze lesz a lehetséges maximumtól. A katalizált reakció legnagyobb ereje, egyéb tényezők azonossága mellett, akkor érhető el, ha minden enzimmolekula részt vesz az átalakulásban, azaz az átalakulásban. az enzim-szubsztrát komplex nagy koncentrációjában (6.5. ábra, V). Ha a szubsztrát koncentráció nem biztosítja az enzim teljes telítettségét (6.5. ábra, b), akkor a reakció sebessége nem éri el a maximális értéket.

Rizs. 65.

A - alacsony szubsztrátumkoncentrációnál; 6 - elégtelen szubsztrát koncentrációval; V - amikor az enzim teljesen telített a szubsztráttal

A fenti körülmények között mért enzimreakció sebességét és az enzim szubsztráttal való teljes telítését ún. az enzimreakció maximális sebessége (V).

Az enzimreakció sebességét akkor határozzuk meg, amikor az enzim nincs teljesen telítve a szubsztráttal. v.

Az enzimkatalízis a következő diagrammal leegyszerűsíthető:

ahol F jelentése enzim; S - szubsztrát; FS - enzim-szubsztrát komplex.

Ennek a folyamatnak minden szakaszát egy bizonyos sebesség jellemez. Az enzimatikus reakció sebességének mértékegysége az időegység alatt átalakult szubsztrát móljainak száma(ugyanaz, mint a normál reakció sebessége).

Az enzim és a szubsztrát kölcsönhatása enzim-szubsztrát komplex kialakulásához vezet, de ez a folyamat visszafordítható. Az előre és fordított reakciók sebessége a reaktánsok koncentrációjától függ, és a megfelelő egyenletek írják le:

Egyensúlyi állapotban a (6.3) egyenlet érvényes, mivel az előre és a fordított reakció sebessége egyenlő.

Az előre (6.1) és a fordított (6.2) reakciók sebességértékeit behelyettesítve a (6.3) egyenletbe, megkapjuk az egyenlőséget:

Az egyensúlyi állapotot egy megfelelő egyensúlyi állandó K p, egyenlő az előre és fordított reakciók állandóinak arányával (6.5). Az egyensúlyi állandó reciproka ún szubsztrát állandó Ks, vagy az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója:

A (6.6) egyenletből kitűnik, hogy a szubsztrátállandó az enzim-szubsztrát komplex nagy koncentrációinál csökken, i.e. nagy stabilitással. Következésképpen a szubsztrát állandó jellemzi az enzim és a szubsztrát affinitását, valamint az enzim-szubsztrát komplex képződésének és disszociációjának sebességi állandóinak arányát.

A szubsztráttal való enzimtelítés jelenségét Leonor Michaelis és Maud Mepten tanulmányozta. Az eredmények matematikai feldolgozása alapján levezették a (6.7) egyenletet, amely a nevüket kapta, amelyből jól látható, hogy magas szubsztrátkoncentrációnál és alacsony szubsztrátállandónál az enzimreakció sebessége a maximumra hajlik. . Ez az egyenlet azonban korlátozott, mert nem veszi figyelembe az összes paramétert:

Az enzim-szubsztrát komplex a reakció során különböző irányban átalakulhat:

• kiindulási anyagokká disszociálnak;
• termékké alakul át, amelyből az enzim változatlan formában válik le.

Ezért az enzimatikus folyamat átfogó hatásának leírására a fogalom Michaelis állandók Kt, amely az enzimatikus katalízis mindhárom reakciójának sebességi állandói közötti összefüggést fejezi ki (6.8). Ha mindkét tagot elosztjuk az enzim-szubsztrát komplex képződésének reakciósebesség-állandójával, akkor a (6.9) kifejezést kapjuk:

A (6.9) egyenletből egy fontos következmény következik: a Michaelis-állandó mindig annyival nagyobb, mint a szubsztrátállandó k 2 /k v

Számszerűen K t megegyezik a szubsztrát azon koncentrációjával, amelynél a reakciósebesség a maximális lehetséges sebesség fele, és megfelel az enzim szubsztráttal való telítettségének, amint az 1. ábrán látható. 6,5, b. Mivel a gyakorlatban nem mindig lehet elérni az enzim teljes telítettségét a szubsztráttal, pontosan K t enzimek kinetikai jellemzőinek összehasonlító jellemzésére használják.

Az enzimreakció sebessége, amikor az enzim nincs teljesen telítve a szubsztráttal (6.10), az enzim-szubsztrát komplex koncentrációjától függ. Az arányossági együttható az enzim és a termék felszabadulásának reakcióállandója, mivel ez megváltoztatja az enzim-szubsztrát komplex koncentrációját:

A transzformációk után a fenti függőségek figyelembevételével a (6.11) egyenlettel írjuk le az enzimreakció sebességét, amikor az enzim nincs teljesen telítve a szubsztráttal, azaz. az enzim, a szubsztrát koncentrációjától és azok affinitásától függ K s:

Az enzimatikus reakció sebességének grafikus függése a szubsztrát koncentrációjától nem lineáris. Amint az az ábrából nyilvánvaló. 6.6, a szubsztrátkoncentráció növekedésével az enzimaktivitás növekedése figyelhető meg. Ha azonban elérjük az enzim maximális telítését a szubsztráttal, az enzimreakció sebessége maximális lesz. Ezért a reakció sebességkorlátozó tényezője az enzim-szubsztrát komplex képződése.

A gyakorlat azt mutatja, hogy a szubsztrátkoncentrációkat általában sokkal kisebb értékekben fejezik ki, mint az egység (10 6 - 10 3 mol). Elég nehéz ilyen mennyiségekkel kalkulálni. Ezért G. Lineweaver és D. Burke azt javasolta, hogy egy enzimreakció sebességének grafikus függését ne direkt koordinátákkal, hanem inverzekkel fejezzék ki. Abból a feltevésből indultak ki, hogy egyenlő mennyiségek esetén az inverzeik is egyenlők:

Rizs. 6.6.

A (6.13) kifejezés transzformálása után egy ún Lineweaver-Burk egyenlet (6.14):

A Lineweaver-Burk egyenlet grafikus függése lineáris (6.7. ábra). Az enzim kinetikai jellemzőit a következőképpen határozzuk meg:

• az ordináta tengelyen levágott szakasz egyenlő 1/V;
• az abszcissza tengelyen levágott szakasz egyenlő -1 /To t.

Rizs. 6.7.

Úgy gondolják, hogy a Lineweaver-Burk módszer lehetővé teszi a maximális reakciósebesség pontosabb meghatározását, mint a közvetlen koordinátákban. Az enzimgátlásra vonatkozóan is értékes információk nyerhetők ki ebből a grafikonból.

Vannak más módok is a Michaelis-Menten egyenlet átalakítására. A grafikus függőségek a különféle külső hatások enzimatikus folyamatra gyakorolt ​​hatásának tanulmányozására szolgálnak.