Стадии пцр. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод высокой точности обнаружения конкретных возбудителей инфекций

Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии. В настоящий момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики .

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Во-первых, данный метод используется для выявления возбудителей различных инфекционных заболеваний с высокой точностью.

Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

Каждый живой организм имеет свои уникальные гены. Гены располагаются в молекуле ДНК, которая собственно и является «визитной карточкой» каждого конкретного организма. ДНК (генетический материал) – это очень длинная молекула, которая состоит из «кирпичиков», называемых нуклеотидами. У каждого возбудителя инфекционных заболеваний они расположены строго специфично, то есть в определенной последовательности и комбинации. Когда необходимо понять имеется ли у человека тот или иной возбудитель, забирается биологический материал (кровь, моча, слюна, мазок), который содержит ДНК или фрагменты ДНК микроба. Но количество генетического материала возбудителя очень мало, и невозможно сказать какому именно микроорганизму он принадлежат. Для решения этой задачи и служит ПЦР. Суть полимеразной цепной реакции заключается в том, что берется малое количество материала для исследования, содержащего ДНК, а в процессе ПЦР происходит увеличение количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю и, таким образом, его можно идентифицировать.

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Идея метода ПЦР принадлежит американскому ученому K.Mullins, которую он предложил в 1983 году. Однако широкое клиническое применение получила лишь в средине 90-х годов XXвека.

Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа.

Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

Помимо ДНК такую же структуру имеет РНК – рибонуклеиновая кислота, отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил. РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку. Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент -«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» - последовательности из 5-15 нуклеотидов. Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии , микоплазмы , вирусов) экспериментально.

Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

Этапы проведения ПЦР исследования

Забор биологического материала для исследования

В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию.

В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I этап ПЦР - Подготовка генетического материала для копирования.
Происходит при температуре 95° С, при этом нити ДНК разъединяются, и на них могут садиться «затравки».

«Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии , «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

Этап идентификации размноженного генетического материала

Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа (то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т.д.). При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген (краситель), вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе.

На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

Чувствительность различается для различных выявляемых микробов. Так, например, чувствительность метода ПЦР для выявления вируса гепатита С составляет 97-98%, чувствительность для выявления уреаплазмы – 99-100%.

Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного.
Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.

ПЦР в диагностике инфекций
Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.
Основные области применения ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
2. контроль эффективности проведенной терапии
3. уточнение вида возбудителя

ПЦР используется в акушерстве, гинекологии, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, клинике инфекционных болезней, офтальмологии, неврологии, фтизиопульмонологии и др.

Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
2. герпетиформные вирусы
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

1. Выделение ДНК
2. Амплификация ДНК-фрагментов
3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5-2 часа.

0Array ( => Анализы) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256... С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

5360 руб.Стоимость комплексной программы у врача гастроэнтеролога

СКИДКА 25%НА ПРИЕМ ВРАЧА КАРДИОЛОГА

- 25%первичный
приём врача
терапевта по выходным

5 160 руб.вместо 5 420 руб. Обследование мужчин на урологические инфекции

АЛЛЕРГОЛОГИЯ5 120 руб. вместо 5 590 руб.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки.

Таким образом, даже если среди миллионов клеток человеческого организма затеряется не сам живой вирус, а лишь частица его ДНК, то ПЦР, если ей ничто не помешает, пожалуй, справится с задачей и сообщит о пребывании «чужака» положительным результатом. В этом суть ПЦР и ее основное достоинство.

Достоинства и недостатки

К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?

Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии , а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком. Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против».

Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:

• Высокая специфичность , достигающая 100%, обусловленная присутствием в отобранном образце частиц нуклеиновых кислот, присущих конкретному организму, но чужеродных человеку;
• Высокая производительность , ведь ПЦР – высокотехнологичная автоматизированная методика, предоставляющая возможность проведения тестирования в день забора материала и избавления, таким образом, пациента от лишних треволнений;
• ПЦР, работая над одной пробой, способна провести несколько исследований и обнаружить несколько возбудителей , если ей будет такое задание. Например, при диагностике хламидийной инфекции, где ПЦР относится к основным методам, наряду с хламидией, можно обнаружить и нейссерию (гонококк) – возбудитель . Причем, на достоверности результатов это негативно не отражается;
• Тестирование методом ПЦР выявляет опасные микроорганизмы в инкубационном периоде , когда они еще не успели нанести ощутимый вред организму, то есть, ранняя диагностика предупреждает о грядущем развитии патологического процесса, что дает возможность подготовиться к нему и принять во всеоружии.

Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.

Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат , указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования. Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.

Чего «боится» ПЦР, что она умеет и как к ней подготовиться?

Как в любых других исследованиях, иной раз результаты теста оказываются ложноположительными или ложноотрицательными , где ПЦР исключением не является. Подобное может происходить в случаях:

1. Нарушения технологического процесса на одном из этапов реакции;
2. Несоблюдения правил забора материала, его хранения или транспортировки;
3. Присутствие посторонних примесей в материале.

Это говорит о том, что к ПЦР – диагностике инфекций нужно подходить внимательно, осторожно и аккуратно, иначе образцы материала могут поменять свое структурное строение или вовсе разрушиться.

Этапы ПЦР-диагностики. Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования

ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой:

• Туберкулез различной локализации, пневмония (в том числе и атипичная, вызванная хламидией);
• Детские инфекции (коревая краснуха, паротит, корь);
• Дифтерия;
• Сальмонеллез;
• Зоонозная инфекционная болезнь – листериоз (заболевание характеризуется многообразием симптомов с поражением лимфоузлов, ЦНС, внутренних органов);
• Заболевания, обусловленные проникновением вируса Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз и др.);
• Онкологическая патология, спровоцированная папилломовирусной инфекцией (ВПЧ и его типы);
• Боррелиоз (болезнь Лайма, клещевой энцефалит);
• Хеликобактерная инфекция, возбудителем которой является проживающий в желудке человека микроб Helicobacter pylori. Доказано, что хеликобактер становится причиной развития рака желудка или 12-перстной кишки;
• и практически все .

ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка. Аналогично себя ведут и . Некоторые из них («торч») относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи.

Как правильно подготовиться, чтобы получить достоверный результат?

Сразу заметим, что подготовка к ПЦР довольно простая, никаких особых усилий со стороны пациента не требующая. Нужно лишь выполнить три несложных задания:

1. Не иметь половых контактов за 24 часа до того, как сдать анализ;
2. Для забора и анализа крови из вены нужно прийти на голодный желудок, пить, кстати, тоже нельзя;
3. Сдать мочу следует ночную (утром – в стерильную баночку, приобретенную накануне в аптеке).

ПЦР может работать в любой биологической среде

Метод ПЦР не отличается «кровожадностью», поэтому приемлет любую биологическую среду, содержащую предполагаемый инфекционный агент.Обычно выбор – что нужно взять для исследования, остается за врачом.

Таким образом, в поисках возбудителя, кроме анализа крови (хотя он тоже подходит и в большинстве случаях берется параллельно другому материалу), можно использовать:

• (выделения урогенитального тракта);
• Соскоб слизистых ротовой полости, конъюнктивы, носоглотки, половых путей (у женщин берут из шейки матки и влагалища, у мужчин – из уретры);
• Слюну;
• Сперму;
• Сок предстательной железы;
• Ткани плаценты и амниотиотическую жидкость (околоплодные воды);
• Осадок мочи (после центрифугирования), например, для выявления некоторых ИППП и микобактерий туберкулеза;
• Мокроту и плевральную жидкость с той же целью;
• Экссудаты;
• Спинномозговую жидкость при подозрении на инфекционное поражение ЦНС;
• Биопсийный материал (биоптат), взятый из печени, 12-перстной кишки, желудка и пр.

К вышеперечисленному хочется добавить, что материала для тестирования во всех случаях, даже в соскобах и выделениях, будет достаточно, так как тестирование методом ПЦР больших объемов не требует, анализу хватает и нескольких микролитров, которые обычно берут в микропробирку типа «эппендорф» и отправляют на исследование.

Болезни и применение ПЦР

ВИЧ и полимеразная цепная реакция

Обычно при прохождении анонимного обследования в случае положительных результатов иммуноблотинга, диагностику повторяют заново. Если диагноз подтверждается, пациенту назначают дополнительные исследования:

1. Определение с помощью иммунологических реакций абсолютных значений количества лимфоцитов CD 4 (иммунокомпетентные клетки – Т-хелперы или помощники), которые инфекция поражает в первую очередь, после чего они теряют свои основные свойства и не могут отличить «свое» и чужое». Циркулирующую в плазме крови РНК вируса они принимают за нормальные клетки организма и не реагируют на них;
2. Обнаружение РНК вируса методом ПЦР и расчет концентрации вирусных частиц с целью установления стадии, тяжести патологического процесса и прогноза с учетом этих данных . Разумеется, слово «норма» в этом плане не существует, поскольку реакция всегда положительна, а расшифровка цифровых значений находится в компетенции врача.

ПЦР и гепатиты

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей , чаще всего тест используется для диагностики С гепатита, который плохо определяется другими методами.

Вирус гепатита С (РНК-содержащий) по своему поведению в организме человека напоминает ВИЧ. Вклиниваясь в геном клеток печени (гепатоцитов), он пребывает там в ожидании своего часа, который может наступить хоть через 2 года, хоть через 20 лет, поэтому медики прозвали его «ласковым убийцей». Гепатит С приводит к формированию злокачественного процесса в печеночной паренхиме, который проявляется на поздних стадиях. Все эти события иммунная система не замечает, принимая вирус за гепатоцит. Правда, антитела к вирусу в некоторых количествах вырабатываются, однако они не обеспечивают достойный иммунный ответ. Для диагностики ИФА на гепатит С не очень информативен, поскольку указывает на то, что вирус оставил следы, а ушел ли сам – неизвестно. При ВГС известны случаи самоизлечения, в то время как антитела против вируса остаются и продолжают циркулировать пожизненно (иммунологическая память). ПЦР заметно опережает образование антител и может выявить вирусную частицу уже через 1-1,5 недели, в то время как АТ могут появиться в интервале от 2 месяцев до полугода

ПЦР-диагностика в случае подозрения на разгул вируса гепатита С в организме человека является наиболее оптимальным методом исследования, ибо только она способна распознать присутствие «ласкового врага» в крови или биоптате печени пациента.

Однако иной раз имеют место случаи, когда АТ положительны, а результат ПЦР – отрицательный. Такое иногда происходит при очень низком количестве вируса или при его «дремлющем» состоянии в печени без выхода в кровяное русло. Чтобы все-таки найти истину, у пациента берут повторный анализ, а то и не один.

Папилломовирусная инфекция

Если не произойдет самоизлечение, тоже может, ничем себя не проявляя, долго персистировать в организме хозяина, который об этом даже не подозревает, поскольку ПЦР сделать не доводилось, а симптомы болезни отсутствовали. Однако наличие папилломовирусной инфекции, пусть и латентной, далеко не безразлично для здоровья человека, где особую опасность несут определенные типы вируса, вызывающие онкологические заболевания (типы 16, 18).

Чаще от ВПЧ страдает женская половина населения, так как вирус больше любит женскую половую сферу, а особенно – шейку матки, где некоторые типы вирусов способствуют развитию диспластических процессов, а затем и рака шейки матки, если не лечить дисплазию и дать волю вирусу. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

TORCH-инфекции и ИППП настолько взаимосвязаны, что, порой, трудно определить, к какой группе следует отнести тот или иной возбудитель. В них вообще бывает сложно разобраться, так как это довольно разнообразные группы микроорганизмов, которые могут передаваться половым путем всегда или только при определенных условиях (иммунодефицит), а могут представлять интерес лишь при беременности, ввиду возможного негативного влияния на ее течение и на плод.

ПЦР – главный метод обнаружения скрытых инфекций

В основе развития клинических проявлений лежат разные возбудители, найти которые бывает под силу только ПЦР, что и является ее основной задачей иногда совместно с ИФА, а иногда в качестве единственного подтверждающего теста, особенно, если симптоматика заболевания отсутствует. Такую непростую ситуацию может создавать полимикробная инфекция, которая, помимо явных возбудителей, включает еще и условно-патогенные.

Уреаплазма зачастую рассматривается в паре с микоплазмой. И это неспроста. Данные виды, как и хламидию, не относят ни к вирусам, ни к бактериям, они проживают внутри клеток и относятся к ИППП, хотя их присутствие в здоровом организме тоже далеко не редкость. Так вот, чтобы отличить здорового носителя от больного человека, нужны особые методы, где ПЦР считается наиболее надежным, поскольку, ввиду особенностей строения и поведения этих микроорганизмов, другие исследования оказываются неэффективными.

Что касается (тип 1, 2) и , который тоже относится к герпесвирусам (тип 5), то здесь тоже ситуация неоднозначная. Инфицированность населения земного шара приближается к 100%, поэтому в данном случае очень важна идентификация вируса и его доза, что особенно играет роль при беременности, ведь взрослому человеку, вирус, прижившийся в его организме, часто не доставляет никаких хлопот и признаков заболевания не дает.

Поэтому не следует игнорировать назначенное врачом подобное обследование, ведь в некоторых случаях полимеразная цепная реакция является обязательным и необходимым методом лабораторной диагностики, способным защитить от серьезных осложнений не только женщину, но и маленького, еще не родившегося, человечка.

В заключение хочется отметить, что такой замечательный метод, как ПЦР, вот уже более 30 лет служит человечеству. При этом, задачи теста не ограничиваются поиском возбудителей инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция, рожденная на почве молекулярной биологии, неразрывно связана с генетикой, она успешно применяется в криминалистике для идентификации личности , в судебной медицине для установления отцовства, в ветеринарии, если клиника для животных имеет возможности приобретать дорогое оборудование, а также в других сферах (промышленность, сельское хозяйство и пр.).

Видео: ПЦР – суть и применение

Анализ ПЦР – современный и высокоточный метод диагностики, позволяющий выявлять возбудителя инфекции независимо от стадии патологии. На сегодня этот способ обследования признан наиболее достоверным, так как он исключает получение ложных данных благодаря высокому уровню специфичности.

Суть метода ПЦР

Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция , позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Явление ПЦР было открыто в 20 веке американским ученым Кэри Мюллисом, благодаря которому в разы сократилось время постановки точного диагноза, а следовательно, врачи стали быстрее назначать адекватные терапевтические мероприятия.

Суть анализа ПЦР заключается в многократном увеличении фрагментов ДНК возбудителя, полученного из биологических проб пациента (мочи, крови, слюны и других). Эта методика позволяет увеличить в искусственной среде определенные участки генетического материала при помощи специальных ферментов, к тому же количество исследуемых фрагментов растет до такой степени, что можно их визуально исследовать.

Стоит отметить, что при анализе ПЦР копируются только определенные участки, играющие важную роль в диагностике. Если они присутствуют в организме пациента в ничтожно малом количестве, то этот анализ сможет их выявить.

Методика ПЦР активно используется в медицинской практике для изучения инфекционных и наследственных заболеваний, ведь помимо простого увеличения количества генетического материала (амплификации), он позволяет сращивать отдельные фрагменты ДНК и вводить мутации, осуществляя контроль за генами, которые вызывают опасения.

Что выявляет анализ ПЦР

Анализ ПЦР широко применяется в различных сферах медицины. Конечно, чаще всего он используется в гинекологии и урологии, но методика актуальна и для пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, онкологии и других областей.

Анализ ПЦР позволяет выявить вирусы на различных стадиях заболевания, также он способен выявить скрытые или «спящие» микроорганизмы, которые не вызывают появления клинических признаков:

• Вирус папилломы человека разных типов (ВПЧ);
• Хламидии;
• Трихомонады;
• Возбудителя гонореи;
• Микоплазмы;
• Уреаплазмы;
• Гарднереллы;
• Грибы кандида;
• Микробактерии туберкулеза;
• Вирусы гепатита А, В и С;
• Хеликобактерии;
• Вирусы герпеса;
• Цитомегаловирусы (ЦМВ);
• Вирусы Эпштейна-Барра.

Преимущества анализа ПЦР

1. Высокая точность анализа: риск получения ложноотрицательных результатов минимален;
2. Специфичность методики: анализ ПЦР позволяет выделить конкретный возбудитель инфекции, его вид и тип;
3. Повышенная чувствительность: анализ ПЦР определяет даже несколько фрагментов ДНК микроорганизма;
4. Возможность исследования разных биологических сред организма;
5. Скорость получения результатов: их можно получить через 4-5 часов после процедуры;
6. Возможность выявления нескольких микроорганизмов из одной пробы биологического материала.

Анализ ПЦР активно используется врачами разных специальностей, при этом отодвигаются на второй план другие методы диагностики. Стоит отметить, что эта процедура позволяет выявить носителей инфекции и латентные формы болезни, при которых нет клинических проявлений, но эти возбудители негативно отражаются на общем состоянии организма и его функциональности, а пациенты представляют опасность для окружающих.

Подготовка и проведение анализа ПЦР

Фрагменты ДНК микроорганизмов находятся в разных биологических средах пациента. Врачи сами определяют области взятия материалов для анализа ПЦР, которые зависят от типа заболевания и его локализации. Если вы обратились к венерологу с целью выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), то будут исследованы выделения из половых органов (мазок или соскоб с шейки матки, влагалища) и мочеиспускательного канала, а также кровь и моча.

Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты.

Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций:

• Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться;
• В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений;
• Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней;
• За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек;
• Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти;
• За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур (сауны, бани и т.п.);
• За 2 недели до анализа ПЦР необходимо прекратить прием антибактериальных средств;
• За неделю до обследования приостанавливают использование интимных гелей, мазей и вагинальных свечей.

Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными или отрицательными. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.

Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.

Анализ ПЦР во время беременности

Беременность – это особенный период в жизни каждой женщины. В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках (до 12 недель), но иногда назначают и во время 2 триместра.

Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. В большинстве случаев, анализ ПЦР проводят по поводу хламидий, уреаплазм, микоплазм, цитомегаловируса, герпеса и ВПЧ. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов (12 и более).