4.2. BIOLOGICKÉ A MIKROBIOLOGICKÉ FAKTORY

Bakteriologická diagnostika brušného týfusu a paratýfusu A, B a C

Dátum zavedenia: od momentu schválenia

1. VYVINUTÉ: FGUN Petrohrad NIIEM ich. Pasteur z Rospotrebnadzor (L.A. Kaftyreva, Z.N. Matveeva, G.F. Trifonova); GOUVPO "St. Petersburg State Medical Academy pomenovaná po I.I. Mechnikov" Federálnej agentúry pre zdravie a sociálny rozvoj (A.G. Boytsov).

3. SCHVÁLENÉ prednostom Federálna služba o dohľade v oblasti ochrany práv spotrebiteľa a ľudského blaha, hlavný štátny sanitár Ruskej federácie G. G. Onishchenko 29.12.2007 0100/13745-07-34

4. ZAVEDENÉ od momentu schválenia.

5. PRVÝ KRÁT PREDSTAVENÉ.

1 oblasť použitia

1 oblasť použitia

1.1. Smernice stanovujú základné princípy a znaky bakteriologickej diagnostiky brušného týfusu a paratýfusu A, B a C; obsahuje moderné informácie o biologických vlastnostiach patogénov, rezistencii na antibakteriálne liečivá, živných médiách na ich izoláciu a vlastnostiach diferenciácie týfusových a paratýfových patogénov od iných sérologických variantov Salmonella.

2. Zoznam skratiek

ABP - antibakteriálny liek

BCA - bizmut sulfitový agar

MPU - liečebno-preventívne zariadenie

MIC - minimálna inhibičná koncentrácia

P - stredná

U - stabilný

H - citlivý

RIF - imunofluorescenčná reakcia

CNS – centrálny nervový systém

V tabuľkách:

"+" - pozitívna reakcia v prvý deň;

"-" - negatívna reakcia počas 4-20 dní;

"(+)" - oneskorená pozitívna reakcia počas 2-20 dní;

d - rôzne enzymatické reakcie.

Je možná diferenciácia na enzymatické varianty.

3. Všeobecné ustanovenia

3.1. Brušný týfus a paratýfus A, B a C sú antroponotické črevné infekcie spôsobené Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B a Salmonella Paratyphi C. zriedkavo - paratýfus C.

3.2. Ochorenia sú charakterizované ulceróznymi léziami lymfatického systému tenkého čreva, bakteriémiou, horúčkou, cyklickým klinickým priebehom s ťažkou intoxikáciou, roseolóznou vyrážkou na koži tela, hepato- a splenomegáliou. Zápcha je bežnejšia ako hnačka. Ulcerácia Peyerových plátov ilea asi v 1 % prípadov vedie k črevnému krvácaniu a perforácii čreva s najnepriaznivejšími následkami pre pacienta.

3.3. Diagnóza brušného týfusu a paratýfusu A, B a C sa robí na základe klinických príznakov ochorenia s prihliadnutím na epidemiologickú anamnézu a údaje z komplexného laboratórneho vyšetrenia, ktoré zahŕňa klasické bakteriologické a sérologické metódy. Bakteriologická diagnostika má prioritný význam, pretože V tomto prípade je možné získať najviac úplné informácie o biologických vlastnostiach patogénu vrátane jeho citlivosti na antibakteriálne lieky.

3.4. Použitie antimikrobiálnych látok na etiotropná terapia brušný týfus a paratýfus umožnili na jednej strane znížiť úmrtnosť z 10-20% na menej ako 1% a na druhej strane komplikovali laboratórnu diagnostiku, pretože často sa odber vzoriek materiálu na laboratórny výskum vykonáva po začatí antibiotickej terapie. Táto skutočnosť si vyžaduje starostlivejší prístup k otázke výberu materiálu na výskum, preberania skúmaného materiálu a techník výskumu.

3.5. Modernou črtou epidemiológie brušného týfusu je prudké zvýšenie frekvencie importu (prenášania) infekcie z území endemických pre túto chorobu, z blízkych i vzdialených krajín, ako aj infekcií ruských obyvateľov pri odchode do týchto krajín a v procese migrácie v rámci krajiny. Ďalším znakom je prítomnosť veľkého kontingentu vysokého epidemiologického rizika v podobe osôb bez trvalého pobytu, medzi ktorými je zaznamenaný vysoký výskyt brušného týfusu.

3.6. Tieto usmernenia boli vypracované s cieľom zjednotiť metódy bakteriologickej diagnostiky týfusu a paratýfusu A, B a C, ako aj správnu interpretáciu výsledkov laboratórnej štúdie, berúc do úvahy moderné vlastnosti kliniky, liečby a epidemiologickej situácie v konkrétnych oblastiach.

4. Indikácie pre bakteriologickú diagnostiku

Indikáciou na bakteriologické vyšetrenie biologického materiálu na prítomnosť patogénov brušného týfusu a paratýfusu A, B a C je potreba vyšetrenia:

4.1) pacienti s podozrením na brušný týfus, ako aj s horúčkou neznámej etiológie, trvajúcou 5 alebo viac dní;

4.2) osoby, ktoré boli v kontakte s pacientmi s brušným týfusom a paratýfusom A, B, C;

4.3) zamestnanci určitých profesií, odvetví a organizácií pri prijatí do práce a podľa epidemiologických indikácií;

4.4) osoby pred prijatím do nemocníc a špecializovaných sanatórií podľa klinických a epidemiologických indikácií;

4.5) osoby pri registrácii na nemocničné ošetrenie do nemocníc (oddelení) psycho-neurologického (psychosomatického) profilu, domovov seniorov, internátov pre ľudí s chronickým duševným ochorením a léziami CNS, do iných typov uzavretých ústavov s nepretržitou prevádzkou;

4.6) pacienti s brušným týfusom a paratýfusom po vymiznutí klinických príznakov ochorenia pred prepustením z nemocnice;

4.7) osoby, ktoré počas dispenzárneho pozorovania ochoreli na brušný týfus a paratýfus;

4.8) chronických bakteriálnych nosičov identifikovaných medzi zamestnancami určitých profesií, odvetví a organizácií pri opätovnom zamestnaní v týchto podnikoch a zariadeniach;

4.9) rezový materiál v prípade podozrenia na brušný týfus a paratýfus.

5. Logistika metódy

5.1. Štandardné testovacie a pomocné zariadenia, meracie prístroje pre mikrobiologické laboratóriá.

5.2. Živné pôdy, diagnostické séra a chemické reagencie na kultiváciu, izoláciu, identifikáciu a stanovenie citlivosti pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C na antibakteriálne liečivá.

5.3. Na laboratórnu diagnostiku týfusu a paratýfusu a detekciu nosičov baktérií by sa mali používať živné pôdy a činidlá schválené na použitie na území Ruskej federácie v súlade so zavedeným postupom.

6. Laboratórna diagnostika týfusu a paratýfu

6.1. Princíp bakteriologickej metódy je založený na detekcii živých mikroorganizmov v rôznych biologických substrátoch (krv, moč, stolica, žlč, kostná dreň, roseola) v závislosti od štádia ochorenia. Na tento účel sa vysieva určité množstvo biologického materiálu na špeciálne živné pôdy, nasleduje inkubácia v termostate a identifikácia vyrastených kolónií mikroorganizmov charakteristických pre S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B a S. Paratyphi C, podľa kultúrnych a enzymatických vlastností a antigénnych charakteristík.

6.2. Iba bakteriologická štúdia môže poskytnúť presnú etiologickú diagnózu a kontrolu uvoľňovania tela z patogénu. S ohľadom na diferenciálnu diagnostiku brušného týfusu a paratýfusu je jedinou metódou laboratórne štúdium biologického materiálu s izoláciou patogénu a jeho identifikáciou na úroveň sérologického variantu, tk. klinický priebeh infekčného procesu nie vždy umožňuje rozlíšiť medzi týmito nosologickými formami.

7. Bakteriologické vyšetrenie

7.1. Izolácia pôvodcov týfusu a paratýfusov A, B a C sa uskutočňuje podľa rovnakej schémy bakteriologického vyšetrenia biomateriálov.

7.2. Postup pri zbere materiálu pre laboratórny výskum SP 3.1.1.2137-06 bola stanovená pre týfus a paratýfus.

7.3. Technika zberu a transportu biomateriálov do mikrobiologických laboratórií je popísaná v MU 4.2.2039-05.

7.4. Materiály na bakteriologické vyšetrenie na účely diagnostiky týfusu a paratýfusu sú:

krv;

výlučky;

moč;


Patogény možno izolovať aj z:

roseol;

kostná dreň;

materské mlieko.

Materiálom pre bakteriologický výskum na identifikáciu nosičov baktérií podľa SP 3.1.1.2137-06 sú:

výlučky;

moč;

žlč (obsah dvanástnika).

7.5. Štúdium prierezového materiálu sa vykonáva s cieľom objasniť diagnózu.

7.6. Odber biologického materiálu na laboratórny výskum sa vykonáva pred začatím etiotropnej liečby: zdravotníckym pracovníkom, ktorý má podozrenie na týfus-paratýfus; v prípade skupinovej a ohniskovej chorobnosti - odborníkmi inštitúcií Rospotrebnadzor a personálom zdravotníckych zariadení. Od hospitalizovaných pacientov sa na urgentnom príjme nemocnice odoberá materiál na bakteriologické vyšetrenie.

7.7. Od osôb, ktoré komunikovali s pacientmi alebo dopravcami (kontakty), odber materiálu realizujú zdravotnícki pracovníci zdravotníckych zariadení a iných organizácií a inštitúcií na mieste, kde sú pacienti identifikovaní.

7.8. Biomateriál pre laboratórny výskum je sprevádzaný špeciálnym smerom. Doručovanie materiálu samotnými subjektmi nie je povolené. Ak nie je možné včas dodať materiál, použijú sa konzervačné prostriedky a transportné médiá (tabuľka 1).

8. Bakteriologický krvný test

Indikáciou na vyšetrenie krvi je podozrenie na týfus-paratýfus alebo febrilný stav neznámeho pôvodu (horúčka neznámeho pôvodu), pozorovaný 5 a viac dní (SP 3.1.1.2137-06).

Pomer krv - živná pôda by mal byť 1:10-1:60. Počet samostatne odobratých vzoriek krvi a čas ich odberu určuje ošetrujúci lekár podľa MU 4.2.2039-05 pre horúčku neznámeho pôvodu alebo podľa MU 04-723/3 MZ ZSSR ( 1984) pre podozrenie na týfus-paratýfus. U pacientov, ktorí dostávajú antibakteriálne lieky, vzorky sa musia odobrať bezprostredne pred zavedením (prijatím) ďalšej dávky lieku.

V prítomnosti horúčky je optimálne odoberať krv na pozadí zvýšenia telesnej teploty (nie však na vrchole teploty!). Výsev na živných pôdach sa vykonáva priamo pri lôžku pacienta.

Pri podozrení na týfus-paratýfus je možné použiť na hemokultiváciu médium Rapoport, 20% žlčový bujón, mäsovo-peptónový bujón s prídavkom 1% glukózy (v 100 ml fľaštičkách). Predtým používané hemokultúry v sterilnej destilovanej (kohútikovej) vode. Uprednostňuje sa však použitie špeciálnych kultivačných médií.

Množstvo krvi zasiate vo výške horúčky môže byť 10 ml, neskôr - až 20 ml (u detí - až 5 ml).

Pri horúčke neznámeho pôvodu, ktorá trvá viac ako 5 dní, je spravidla potrebné vyšetriť niekoľko vzoriek krvi. Odber krvi zo žily sa vykonáva podľa MU 4.2.2039-05. Je to nevyhnutné na odlíšenie skutočnej bakteriémie od náhodnej kontaminácie krvi počas venepunkcie (pravdepodobnosť kontaminácie vzorky v dôsledku náhodného prepichnutia mazovej alebo potnej žľazy je 3 %). V tomto prípade sa na hemokultúru používajú dve médiá: 1) médium pre aeróby a fakultatívne anaeróby a 2) médium pre obligátne anaeróby (napríklad „dvojité“ médium + tioglykolové médium podľa nariadenia Ministerstva zdravotníctva ZSSR zo dňa 12.04.85 N 535) alebo univerzálne médium pre aeróby a anaeróby.

Je vhodnejšie použiť priemyselne vyrábané médiá schválené na použitie v Rusku.

Plodiny sa inkubujú pri teplote 37 °C počas 10 dní s denným sledovaním. V tomto prípade sa fľaštičky s "dvojitým" médiom naklonia, čím sa premyje hustá časť média.

Pri absencii známok rastu na 10. deň sa vydá negatívna odpoveď.

Ak sa objavia známky rastu (zákal, začervenanie Rapoportovho média, objavenie sa viditeľných kolónií na hustej časti „dvojitého“ média), výsev sa vykonáva paralelne na polysacharidovom médiu a hustej pôde v Petriho miskách ( krvný agar v prípade horúčky neznámeho pôvodu a médium Endo v prípade podozrenia na týfusový paratýfus).

Priama inokulácia na polysacharidové médiá sa uskutočňuje na skrátenie času štúdie, pričom sa vychádza z predpokladu, že pri očkovaní krvi s vysokou pravdepodobnosťou bude pozorovaný rast monokultúry patogénu. Paralelné nanesenie na médium Endo alebo krvný agar je potrebné na kontrolu tohto predpokladu a na izoláciu čistej kultúry rozdelením jednotlivých kolónií.

Ak sa na týchto médiách pozoruje rast monokultúry, potom sa môžu vziať do úvahy biochemické vlastnosti polysacharidového média. Na kontrolu čistoty kultúry je potrebné vykonať mikroskopiu náteru z polysacharidového média zafarbeného Gramom. V tejto fáze je tiež možné nastaviť aglutináciu na skle s príslušnými aglutinačnými O- a H-salmonelovými sérami a vydať predbežnú odpoveď.

Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na brušný týfus a paratýfus je na obr.1.

Obr.1. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na týfus a paratýfus

Obr.1. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na týfus a paratýfus

Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu je na obr.2.

Obr.2. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu

Obr.2. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu

Priebeh ďalšej identifikácie kultúry podľa kultúrno-morfologických, enzymatických vlastností a sérologických charakteristík je popísaný ďalej v príslušných častiach.

9. Bakteriologické vyšetrenie výkalov

Vzorky stolice sa odoberajú ihneď po defekácii z vydezinfikovanej a dôkladne umytej nádoby, na dno ktorej je položený hárok hrubého čistého papiera. Materiál sa odoberá pomocou lyžice-stierky namontovanej vo veku sterilnej nádoby. Pri absencii nádoby so špachtľou sa na odber materiálu používa akýkoľvek sterilný nástroj (sterilná drevená špachtľa, drôtená slučka, lyžica atď.). V prítomnosti patologických nečistôt je potrebné vybrať oblasti obsahujúce hlien, hnis, vločky, ale bez krvi. Vzorky tekutej stolice sa odoberajú pomocou sterilnej plastovej Pasteurovej pipety s uzavretým zásobníkom.

Objem odoberaného materiálu musí byť minimálne 2 g. Optimálnym materiálom je odoberanie materiálu v prípade dekorovanej stoličky - v množstve vlašského orecha; pri riedkej stolici by mala byť jej vrstva v nádobe aspoň 1,5-2,0 cm Materiál umiestnený v sterilnej nádobe sa do laboratória dodáva do 2 hodín.

Ak sa materiál nepodarí doručiť do laboratória do 2 hodín, odoberá sa do konzervačnej látky (prepravný systém s médiom). Objem materiálu nesmie presiahnuť objem média.

Stolica musí byť v médiu starostlivo homogenizovaná. Vzorky sa môžu pred začiatkom štúdie uchovávať počas dňa v chladničke (4-6 °C).

Transportné médiá a konzervačné látky používané na izoláciu pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C, ako aj iných patogénov akútnych črevných infekcií, sú uvedené v tabuľke 1.

stôl 1

Prepravné médiá a konzervačné látky najčastejšie používané na prepravu fekálií

Názov prostredia	Poskytuje konzerváciu
Streda Carrie Blair	všetky črevné patogény vrátane Campylobacter
Streda Ames	všetky enterobaktérie
Streda Stewart	salmonela a shigella
zmes glycerínu	všetky enterobaktérie okrem Yersinia; preferované pre shigellu
zmes fosfátového pufra	všetky enterobaktérie
borátový tlmivý roztok	všetky enterobaktérie
fyziologický roztok	všetky enterobaktérie vrátane kampylobakterov

Vzorky stolice odobraté priamo z konečníka pomocou rektálneho výteru slúžia predovšetkým na objektivizáciu diagnózy (MU 4.2.2039-05). Materiál odoberá zdravotnícky personál. Súčasťou transportného systému je spravidla špeciálna sonda na odber náteru. Je dôležité si uvedomiť, že prenikanie transportných médií na sliznicu konečníka je neprijateľné! Preto by mal byť rektálny tampón ponorený do transportného média až po odbere materiálu. Pacient je požiadaný, aby si ľahol na bok s bokmi pritiahnutými k žalúdku a zadkom od seba dlaňami. Tampónová sonda sa vloží do konečníka do hĺbky 4 až 5 cm a jemným otáčaním okolo osi sa odoberie materiál z krýpt konečníka. Opatrne vyberte tampónovú sondu a ponorte ju do transportného média. Preprava tampónu bez média nie je povolená.

V laboratóriu sa očkovanie vzoriek stolice uskutočňuje priamo na husté diferenciálne diagnostické živné pôdy a paralelne na obohacovacie médium.

Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov je na obr.3.

Obr.3. Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov

Obr.3. Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov

Z natívnych výkalov sa pripraví suspenzia v 0,9% roztoku chloridu sodného v pomere 1:5-1:10, nechá sa 30 minút, aby sa usadili veľké častice. Potom sa jedna kvapka supernatantu naočkuje do misiek s hustým živným médiom a 1 ml suspenzie sa naočkuje do obohacovacieho média (pomer materiálu a média by mal byť 1:5).

Výkaly dodané do laboratória v konzervačnom prostriedku (prepravné médium) sa musia pred inokuláciou starostlivo zhomogenizovať v médiu, potom sa materiál priamo naočkuje na pevné médium a obohacovacie médium v ​​rovnakých pomeroch ako natívne výkaly.

Vzorky stolice odobraté rektálnym tampónom sa vyšetrujú podobným spôsobom ako stolica dodávaná v konzervačnom prostriedku. Malo by sa pamätať na to, že rektálny tampón obsahuje menej mikroorganizmov v porovnaní s natívnou stolicou, preto je potrebné zvýšiť dávku inokula.

Maximálna detekcia S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B a S. Paratyphi C vo výkaloch sa dosahuje použitím obohacovacích médií, hoci u pacientov v akútnom období ochorenia sa patogén často izoluje priamou inokuláciou. Inokulácia na obohacovacie médium súbežne s priamou inokuláciou je povinná!

Všetky očkovania sa inkubujú pri teplote 37 °C na diferenciálnych diagnostických médiách počas 18-24 hodín, na bizmutovo-sulfitovom agare počas 24-48 hodín. stredná). Kolónie charakteristické pre tieto patogény, pestované na hustom médiu, sa skrínujú na polysacharidovom médiu.

Je potrebné poznamenať, že technika nanášania materiálu na povrch platne s hustým médiom by mala zabezpečiť rast izolovaných kolónií typického typu, ktoré možno použiť na vizuálne posúdenie kultúrnych vlastností mikroorganizmu.

Preferovanou metódou na izoláciu S. Typhi je bizmutový sulfitový agar (BCA). Typické kolónie S. Typhi sú čierne a obklopené čiernym alebo hnedým okrajom s kovovým leskom. S. Typhi však často nevyvoláva charakteristické sčernanie ICA, keď dôjde k hojnému rastu, takže misky by sa mali naočkovať, aby sa umožnil rast jednej kolónie.

Vzorky výkalov možno naočkovať na štandardné selektívne médiá pre enterobaktérie schválené na použitie v Ruskej federácii. Preferovanou metódou na izoláciu S. tymhi je však agar bizmutitý siričitan. Priebeh ďalšej identifikácie kultúr podľa enzymatických vlastností a sérologických charakteristík je popísaný ďalej v príslušných častiach.

10. Bakteriologické vyšetrenie moču

Kultivácia moču sa vykonáva na diagnostiku od prvých dní ochorenia až do prepustenia pacienta, ako aj na identifikáciu bakterionosiča. Keďže týfus a paratýfus sa vylučujú močom pravidelne a na krátky čas, testy moču sa musia opakovať v intervaloch 5-7 dní.

Mali by ste dôsledne dodržiavať všeobecné pravidlá pre odber moču, uvedené v MU 4.2.2039-05. Bez ohľadu na spôsob získania moču je potrebné ho doručiť do laboratória do 2 hodín.V extrémnych prípadoch možno moč uchovávať aj cez noc v chladničke.

Malo by sa pamätať na to, že v závislosti od chemické zloženie močom, baktérie v ňom môžu počas skladovania odumrieť a aj sa množiť.

Zvýšenie trvanlivosti materiálu môže veľmi sťažiť interpretáciu výsledku.

Priama inokulácia moču (alebo sedimentu po odstredení) sa vykonáva bez predchádzajúceho obohatenia podľa nariadenia MZ ZSSR N 535 na hutné diferenciálne diagnostické médiá odporúčané pre salmonely vrátane patogénov týfusu a paratýfu. Súčasne sa do obohacovacieho média s dvojnásobnou koncentráciou v pomere 1:1 naočkuje natívny moč, alebo sa močový sediment naočkuje do média s normálnou koncentráciou. Inokulácie sa umiestnia do termostatu pri 37 °C na 18-24 hodín a potom sa obohacovacie médium naočkuje na husté diferenciálne diagnostické médiá. Kolónie pestované na pevnom médiu sú identifikované kultivačnými, enzymatickými a sérologickými vlastnosťami.

11. Bakteriologické vyšetrenie žlče (obsah dvanástnika)

Žlč sa odoberá do troch sterilných skúmaviek alebo sterilných jednorazových nádob oddelene v častiach A, B, C podľa MU 4.2.2039-05 a dodáva sa do laboratória.

Vykonajte štúdiu každej dávky (A, B, C) samostatne alebo pripravte zmes troch dávok. Vzorky sa naočkujú:

na hutných diferenciálnych diagnostických médiách (ICA, Endo, EMS atď.) v množstve 0,5 ml;

v skúmavke (fľaške) so živným vývarom v pomere 1:10. Nie je potrebné očkovanie žlče na obohacovacie médiá, ako samotná žlč je dobrou živnou pôdou pre patogény týfusu a paratýfu.

Inokulované médiá sa inkubujú so zvyškami žlče pri 37 °C.

Po 18-24 hodinách sa skúmajú inokulácie na hustých živných médiách (výsledky rastu na ICA sa berú do úvahy po 24 a 48 hodinách) a uskutoční sa opätovné vysiatie podozrivých kolónií na polysacharidové médium.

Z živného bujónu sa semená robia na hustých diferenciálnych diagnostických médiách.

Zo zvyšnej žlče v prípade negatívneho výsledku priameho výsevu sa po 18-24 hodinách a 3., 5., 7. a 10. deň zhotovujú opakované výsevy na husté diferenciálne diagnostické médiá.

Pestované mikroorganizmy sa identifikujú kultúrno-morfologickými, enzymatickými a sérologickými vlastnosťami.

12. Bakteriologické vyšetrenie materiálu z roseoly

Bakteriologické vyšetrenie ("škrabanie" s roseolou) sa vykonáva v prítomnosti dobre definovanej roseoly. Materiál sa odoberá asepticky. Za týmto účelom sa oblasť kože nad roseolou ošetrí 70% etylalkoholom, potom sa utrie vatovým tampónom navlhčeným sterilným 0,9% roztokom chloridu sodného a vysuší sa sterilným tampónom.

Materiál na výskum (tkanivový mok) sa získava skarifikáciou pokožky nad roseolou skalpelom. Na poškodenú kožu sa aplikujú 1-2 kvapky žlčového bujónu alebo izotonického roztoku chloridu sodného, ​​zmiešajú sa s vyčnievajúcim tkanivovým mokom a odoberú sa Pasteurovou pipetou alebo podobným jednorazovým sterilným zariadením do skúmavky s jedným z tekutých obohacovacích médií (žlč bujón, Rapoport médium atď.). V laboratóriu sa očkovanie udržiava pri teplote 37 °C počas 18-24 hodín, potom nasleduje očkovanie na husté diferenciálne diagnostické médiá (Endo, EMS, ICA).

13. Bakteriologické vyšetrenie kostnej drene

Je všeobecne známe, že v prípade laboratórneho potvrdenia diagnózy brušného týfusu je najúčinnejšie bakteriologické vyšetrenie kostnej drene (naočkovanosť patogénom je 90 – 95 %). Dokonca aj u pacientov s miernymi a vymazanými formami brušného týfusu, ktoré sú ťažké na klinické rozpoznanie, ako aj na pozadí užívania antimikrobiálnych liekov, je inokulácia myelokultúr výrazne vyššia ako hemokultúry.

V praxi sa však bakteriologické vyšetrenie kostnej drene vykonáva veľmi zriedkavo, iba pri zvláštnych príležitostiach. klinické indikácie, pri absencii iných laboratórnych údajov potvrdzujúcich diagnózu brušného týfusu alebo paratýfusu, tk. tento invazívny postup je dosť traumatizujúci. Odber vzoriek materiálu na výskum sa vykonáva iba v nemocnici za prítomnosti príslušného odborníka.

Materiál na bakteriologické vyšetrenie (aspirát) v množstve 0,50-0,75 ml sa získa asepticky punkciou hrudnej kosti (rukoväť alebo telo) a naočkuje sa do skúmavky s jedným z obohacovacích médií (žlčový bujón, Rapoportovo médium a pod.).

Ak sa aspirát nedá naočkovať do obohacovacieho média ihneď po punkcii, odoberie sa do sterilnej skúmavky a ihneď sa odošle do laboratória, kde sa vykoná očkovanie do obohacovacieho média. V laboratóriu sa inokulácie inkubujú pri teplote 37 °C počas 18-24 hodín, po ktorých nasleduje inokulácia na husté diferenciálne diagnostické médiá.

Vykonáva sa ďalší výskum, ako pri bakteriologickom vyšetrení iného biologického materiálu.

14. Živné médiá a činidlá

Zoznam živných médií na izoláciu a identifikáciu patogénov črevných infekcií, najmä enterobaktérií, je rozsiahly a neustále sa rozširuje. Výber konkrétnych prostredí je do značnej miery určený miestnymi ekonomickými podmienkami a tradíciami. Malo by sa však riadiť niekoľkými základnými zásadami.

14.1. Opis kultivačného média by mal uvádzať, že ho možno použiť nielen na detekciu Salmonella, ale aj Salmonella Typhi a S. Paratyphi A, B a C.

14.2. Dehydratované kultivačné médiá od renomovaných výrobcov by sa mali uprednostňovať pred médiami pripravenými priamo v laboratóriu.

14.3. Každá šarža kultivačného média v laboratóriu musí byť kontrolovaná testovacími kmeňmi (interná kontrola kvality).

14.4. Na laboratórnu diagnostiku týfusu a paratýfusu a detekciu nosičov baktérií by sa mali používať živné pôdy a činidlá schválené na použitie na území Ruskej federácie v súlade so zavedeným postupom.

15. Metódy štúdia enzymatických vlastností

V súčasnosti boli na štúdium enzymatickej aktivity mikroorganizmov z čeľade Enterobacteriaceae vrátane patogénov týfusu a paratýfu vyvinuté, vyrobené a registrované rôzne diagnostické testovacie systémy domácej a zahraničnej výroby (od najjednoduchších klasických Hiss médií v skúmavkách a platniach až po automatické analyzátory). Ak testovacie systémy umožňujú identifikovať mikroorganizmus na úrovni rodu a identifikovať charakteristiky enzymatickej aktivity kmeňov, možno ich použiť na identifikáciu patogénov týfusu a paratýfusu. Postup práce s testovacími systémami je podrobne popísaný v návode na použitie a mal by sa prísne dodržiavať.

16. Biologické vlastnosti patogénov

Pôvodcovia týfusu a paratýfusov A, B a C patria do čeľade Enterobacteriaceae, rod Salmonella, enterica species, poddruh I (enterica) a majú morfologické, kultúrne a enzymatické vlastnosti charakteristické pre tento poddruh, druh, rod a čeľaď.

U predstaviteľov rodu Salmonella species enterica sa historicky vyvinula situácia, keď sa sérovary označovali nie antigénnym vzorcom ako u iných baktérií, ale názvami chorôb (ľudských alebo zvieracích), krajiny, mesta alebo ulice, kde boli izolované, atď. Je chybou uvažovať o názvoch týchto druhov, pretože nemajú taxonomický štatút. Názvy najbežnejších sérovarov Salmonella sú však také známe, že je takmer nemožné nahradiť ich antigénnymi vzorcami. Preto sa v modernej Kaufman-Whiteovej schéme pri označovaní Salmonella len enterica poddruh I namiesto druhového označenia používa názov sérovaru, ktorý sa však píše s veľkým písmenom.

Úplné názvy pôvodcov týfusu a paratýfusu sú teda nasledovné:

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhi;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi A;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi B;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi C

V bežnej praxi je možné použiť skrátené verzie názvov:

Salmonella ser. Typhi alebo Salmonella Typhi alebo S. Typhi;

Salmonella ser. Paratyphi A alebo Salmonella Paratyphi A alebo S. Paratyphi A;

Salmonella ser. Paratyphi B alebo Salmonella Paratyphi B alebo S. Paratyphi B;

Salmonella ser. Paratyphi C alebo Salmonella Paratyphi C alebo S. Paratyphi C

16.1. Kultúrne a morfologické vlastnosti

Mobilné gramnegatívne tyčinky netvoria spóry a kapsuly, fakultatívne anaeróby rastú dobre na bežných živných pôdach.

Na jednoduchom živnom agare - kolónie mierne konvexné s hladkým okrajom a hladkým povrchom, vlhké s leskom väčším ako 1 mm.

Na diferenciálnych diagnostických médiách (obsahujúcich laktózu ako rozlišovaciu látku) - priehľadné, bezfarebné alebo modrasté a niekedy ružovkasté alebo farby prostredia kolónie (Endo, Ploskirev, EMS a iné podobné médiá).

Na SS-arape stredne farebné kolónie s čiernym stredom.

Na bizmutovo-sulfitovom médiu sú izolované kolónie S. Typhi, S. Paratyphi B čierne s charakteristickým kovovým leskom, médium pod kolóniou je zafarbené na čierno. Kolónie S. Paratyphi A sú zelenkasté, svetlej farby média, jemné.

Kmene S. Paratyphi B (pôvodca paratýfusu B) na mäsovo-peptónovom agare môžu vytvárať zvýšenú mukoidnú stenu pozdĺž periférie kolónií. Pri skladovaní plodín pri izbovej teplote sa sliznica vyvíja 2-5 dní. Tento príznak nie je trvalý a diagnostický.

16.2. Enzymatické vlastnosti

Štúdium enzymatických vlastností sa uskutočňuje vo vzťahu k súboru sacharidov, viacsýtnych alkoholov, aminokyselín a iných organických zlúčenín používaných pri identifikácii a štúdiu Salmonella a iných enterobaktérií. V praktických laboratóriách sa spravidla používa malý počet testov na identifikáciu hlavných rodov, ktoré sú súčasťou čeľade črevných baktérií. Charakteristiky enzymatických vlastností Salmonella, vrátane pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C, sú uvedené v tabuľke 2.

tabuľka 2

Enzymatické vlastnosti patogénov brušného týfusu a paratýfusov A, B, C

V tomto prípade môžete nákup dokladu zopakovať pomocou tlačidla vpravo.

Došlo k chybe

platba nebola dokončená z dôvodu technickej chyby, hotovosť z vášho účtu
neboli odpísané. Skúste počkať niekoľko minút a zopakujte platbu znova.

substrát			S. Paratyphi A
Glukóza (plyn)

5. Základné formy baktérií

6. Mikroskopická metóda diagnostiky infekčných chorôb

7. Jednoduché a zložité metódy farbenia

8. Mechanizmy farbenia podľa Grama a Ziehla-Neelsena

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Téma 2: Špeciálne metódy farbenia. Zariadenie biologického mikroskopu. Druhy

I. Otázky pre samoukov:

II. základný text

1. Špeciálne metódy farbenia na identifikáciu jednotlivých bakteriálnych štruktúr

2. Farbiace metódy pre jednotlivé skupiny pro- a eukaryotov

3. Štúdium mobility mikroorganizmov

4. Typy mikroskopie

5. Zariadenie biologického mikroskopu

6. Postup pri ponornej mikroskopii

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Téma 3: Morfológia a ultraštruktúra jednotlivých skupín mikroorganizmov: rickettsie, chlamýdie, mykoplazmy, aktinomycéty, spirochéty, huby, prvoky

I. Otázky pre samoukov:

II. základný text

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Teoretické otázky pre hraničnú kontrolu vedomostí

Zoznam praktických zručností

Modul ιι "Fyziológia mikroorganizmov"

I. Otázky pre samoukov:

II. základný text

1. Zloženie a požiadavky na živné pôdy

2. Klasifikácia živných médií

3. Pojmy asepsa a antisepsa

4. Pojem dezinfekcie, spôsoby dezinfekcie a kontrola účinnosti dezinfekcie

5. Pojem sterilizácia, metódy, vybavenie a spôsoby sterilizácie

6. Metódy stanovenia účinnosti sterilizácie

7. Pojem druh, kmeň, kolónia, čistá kultúra mikroorganizmov

8. Metódy izolácie čistých kultúr mikroorganizmov

9. Bakteriologická metóda diagnostiky infekčných chorôb

10. Technika očkovania mikroorganizmami

11. Vlastnosti kultivácie anaeróbnych baktérií

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Diagnostika infekčných chorôb.

ja inscenujem.

II etapa. Účel: akumulácia čistej kultúry

III etapa. Účel: identifikácia študovanej kultúry

IV štádium.

Téma 2: Fyziológia baktérií. Výživa, dýchanie, rozmnožovanie, metabolizmus a enzýmové systémy baktérií. Bakteriologická metóda na diagnostiku infekčných ochorení (2. deň).

I. Otázky pre samoukov:

II. základný text

1. Metabolizmus mikroorganizmov

2. Enzýmové systémy mikroorganizmov

4. Mechanizmy výživy baktérií

6. Klasifikácia baktérií podľa typu dýchania - biologická oxidácia.

7. Fermentácia a jej druhy

8. Podmienky kultivácie baktérií

9. Rast a rozmnožovanie baktérií. Fázy reprodukcie baktérií

10. Bakteriologická výskumná metóda. Uskutočnenie 2. etapy bakteriologickej metódy na izoláciu aeróbov. Kultúrne vlastnosti baktérií.

III. Praktický pracovný plán

4. Vyplňte tabuľku "Klasifikácia mikroorganizmov podľa druhov dýchania"

IV. Príklady situačných úloh

Téma 3: Identifikácia čistých kultúr. Biochemická aktivita baktérií. Bakteriologická metóda na diagnostiku infekčných ochorení (3-dňová).

1. Uskutočnenie štádia III bakteriologickej metódy izolácie čistých kultúr mikroorganizmov. Schéma identifikácie mikroorganizmov

2. Stanovenie čistoty izolovanej kultúry

3. Využitie enzymatickej aktivity baktérií na identifikáciu mikroorganizmov

4. Metódy stanovenia glykolytickej aktivity mikroorganizmov

5. Metódy stanovenia proteolytickej aktivity baktérií

6. Stanovenie bakteriálnych redoxných enzýmov

7. Systémy na biochemickú identifikáciu baktérií

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Modul III "Základy antibakteriálnej chemoterapie"

2. Mechanizmy účinku antibiotík na mikroorganizmy

3. Vedľajšie účinky antibiotík

4. Mechanizmy antibiotickej rezistencie mikroorganizmov

5. Metódy stanovenia citlivosti mikroorganizmov na antibiotiká

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Modul III "Infekcia a infekčný proces"

Téma 2: Infekčný proces. Faktory patogenity baktérií. Biologická metóda diagnostiky infekčných chorôb

základný text

1. Doktrína infekcie. Pojmy "infekcia" a "infekčná choroba"

3. Klasifikácia infekčných chorôb a foriem infekcií

4. Obdobia a následky infekčného ochorenia

5. Patogenita a virulencia, jednotky virulencie

6. Hlavné faktory patogenity mikroorganizmov

7. Mikrobiálne toxíny

8. Biologická metóda diagnostiky infekčných chorôb

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

III modul „Ekológia mikroorganizmov. Základy sanitárnej mikrobiológie»

Téma 3: Mikroflóra ľudského tela. Sanitárne a bakteriologické vyšetrenie vody, vzduchu, pôdy

I. Otázky pre samoukov:

II.Základný text

2. Funkcie normálnej mikroflóry ľudského tela

3. Metódy stanovenia mikroflóry ľudského tela

4. Definícia pojmu dysbakterióza a príčiny jej vzniku

5. Zásady diagnostiky a liečby dysbakteriózy

6. Predmet sanitárnej mikrobiológie a požiadavky na sanitárne indikačné mikroorganizmy

7. Mikroflóra vody, vzduchu a pôdy

8. Metódy stanovenia hygienicko-indikačných mikroorganizmov vody, vzduchu a pôdy

III. Praktický pracovný plán

IV. Príklady situačných úloh

Teoretické otázky pre hraničnú kontrolu vedomostí

Zoznam praktických zručností

Literatúra

9. Bakteriologická metóda diagnostiky infekčných chorôb

Hlavnou metódou mikrobiologickej diagnostiky a „zlatým štandardom“ mikrobiológie je bakteriologická metóda.

Účel bakteriologickej metódy spočíva v izolácii čistej kultúry patogénu z testovaného materiálu, akumulácii čistej kultúry a identifikácii tejto kultúry súborom vlastností: morfologické, tinktoriálne, kultúrne, biochemické, antigénne, prítomnosťou patogenity, faktorov toxigenity a stanovením jej citlivosti na antimikrobiálne lieky a bakteriofágy.

Metóda bakteriologického výskumu zahŕňa:

1. naočkovanie testovaného materiálu do živných médií

2. izolácia čistej kultúry

3. identifikácia mikroorganizmov (určenie príslušnosti k druhu).

Izolácia a identifikácia čistých kultúr aeróbnych a an aeróbne baktérie poskytuje tieto štúdie:

I. fáza (práca s natívnym materiálom)

Účel: získanie izolovaných kolónií

1. Predbežná mikroskopia poskytuje približnú predstavu o mikroflóre

2. Príprava materiálu na výskum

3. Výsadba na husté živné médiá na získanie izolovaných kolónií

4. Inkubácia pri optimálnej teplote, najčastejšie 37°C, 18-24 hodín

II etapa

Účel: získanie čistej kultúry

1. Makroskopické štúdium kolónií v prechádzajúcom a odrazenom svetle (charakteristika veľkosti, tvaru, farby, priehľadnosti, konzistencie, štruktúry, obrysu, povrchu kolónií).

2. Mikroskopické vyšetrenie izolovaných kolónií

3. Testovanie aerotolerancie (na potvrdenie prítomnosti striktných anaeróbov v testovanom materiáli).

4. Výsev kolónií charakteristických pre určitý druh na čisté kultivačné akumulačné médiá alebo elektívne médiá a inkubácia za optimálnych podmienok.

Stupeň III

Účel: Identifikácia izolovanej čistej kultúry

1. Na identifikáciu izolovanej kultúry podľa komplexu biologických vlastností sa študuje nasledovné:

morfológia a farbiace vlastnosti

kultúrne vlastnosti (povaha rastu na živných médiách)

biochemické vlastnosti (enzymatická aktivita mikroorganizmov)

sérologické vlastnosti (antigénne)

virulentné vlastnosti (schopnosť produkovať faktory patogenity: toxíny, enzýmy, obranné a agresívne faktory)

patogénnosť pre zvieratá

fágová lizabilita (citlivosť na diagnostické bakteriofágy)

citlivosť na antibiotiká

iné individuálne vlastnosti

Štádium IV (záver)

Podľa študovaných vlastností sa robí záver o izolovanej kultúre

Prvá etapa výskumu.Štúdium patologického materiálu začína mikroskopiou. Mikroskopia farbeného natívneho materiálu umožňuje približne stanoviť zloženie mikrobiálnej krajiny študovaného objektu, niektoré morfologické znaky mikroorganizmov. Výsledky mikroskopie natívneho materiálu do značnej miery určujú priebeh ďalšieho výskumu a následne sa porovnávajú s údajmi získanými pri očkovaní na živné pôdy.

Pri dostatočnom obsahu patogénnych mikroorganizmov vo vzorke sa očkovanie uskutočňuje na hustých živných médiách (na získanie izolovaných kolónií). Ak je v testovanom materiáli málo baktérií, potom sa očkovanie vykoná na tekuté živné obohacovacie médium. Živné médiá sa vyberajú podľa požiadaviek mikroorganizmov.

Kultivácia mikroorganizmov je možná len pri vytváraní optimálnych podmienok pre ich životne dôležitú činnosť a dodržiavaní pravidiel vylučujúcich kontamináciu (náhodnú kontamináciu cudzími mikróbmi) testovaného materiálu. V skúmavke, banke alebo Petriho miske je možné vytvoriť umelé podmienky, ktoré by vylúčili kontamináciu kultúry inými druhmi. Všetky nádoby a živné pôdy musia byť sterilné a po naočkovaní mikrobiálnym materiálom chránené pred vonkajšou kontamináciou, čo sa dosiahne pomocou zátok alebo kovových uzáverov a viečok. Manipulácie s testovacím materiálom by sa mali vykonávať v zóne plameňa alkoholovej lampy, aby sa vylúčila kontaminácia materiálu z vonkajšieho prostredia, ako aj z dôvodu dodržania bezpečnostných predpisov.

Naočkovanie materiálu na živné pôdy by sa malo vykonať najneskôr do 2 hodín od okamihu ich odberu.

Druhá etapa výskumu.Štúdium kolónií a izolácia čistých kultúr. Po dni inkubácie rastú kolónie na platniach a pri prvom zdvihu je rast nepretržitý a pri ďalšom - izolované kolónie. Kolónia je súbor mikróbov rovnakého druhu, ktoré vyrástli z jednej bunky. Keďže materiál je najčastejšie zmes mikróbov, rastie niekoľko druhov kolónií. Rôzne kolónie sú označené ceruzkou, načrtnuté krúžkom zo strany dna a preštudované (tabuľka 11). Najprv študujte kolónie voľným okom: makroskopické znaky. Miska sa prezerá (bez jej otvárania) zo spodnej strany v prechádzajúcom svetle, zaznamenáva sa priehľadnosť kolónií (priehľadná, ak nezachytáva svetlo; priesvitná, ak čiastočne zachytáva svetlo; nepriehľadná, ak svetlo neprechádza kolónie), zmerajte (v mm) veľkosť kolónií. Potom študujú kolónie zo strany viečka, všímajú si tvar (pravidelný okrúhly, nepravidelný, plochý, konvexný), charakter povrchu (hladký, lesklý, matný, drsný, zvrásnený, mokrý, suchý, slizovitý), farbu (bezfarebný, farebný).

Tabuľka 11. Schéma štúdia kolónií

		Možné charakteristiky kolónie
		Ploché, konvexné, kupolovité, prehĺbené, okrúhle, rozetovité, hviezdicovité
	Veľkosť, mm	Veľký (4-5 mm), stredný (2-4 mm), malý (1-2 mm), trpaslík (< 1 мм)
	Povrchová povaha	Hladký (tvar S), drsný (tvar R), slizký (tvar M), pruhovaný, hrboľatý, matný, lesklý
		Bezfarebné, farbené
	Transparentnosť	Priehľadné, nepriehľadné, priesvitné
	Povaha okrajov	Hladké, zúbkované, strapcové, vláknité, vrúbkované
	Vnútorná štruktúra	Homogénne, zrnité, heterogénne
	Dôslednosť	Viskózny, slizký, drobivý
	Emulgácia v kvapke vody	Dobrý zlý

Poznámka: 5-7 bodov sa študuje pri malom zväčšení mikroskopu.

Rozdiel medzi kolóniami ešte lepšie uvidíte, keď si ich priblížite. Za týmto účelom sa uzavretá miska položí hore nohami na stôl na predmety, kondenzor sa mierne zníži, použije sa malé zväčšenie objektívu (x8), pohybuje sa miskou, v kolóniách sa študujú mikroskopické znaky: povaha okraj (hladký, vlnitý, zúbkovaný, vrúbkovaný), štruktúra (homogénna, zrnitá, vláknitá, homogénna alebo odlišná v strede a po obvode).

Ďalej sa študuje morfológia mikrobiálnych buniek z kolónií. Na tento účel sa z časti každej z označených kolónií urobia nátery zafarbené podľa Grama. Pri odbere včelstiev dbajte na konzistenciu (suché, ak sa včelstvo drobí a ťažko sa prijíma; mäkké, ak sa ľahko nasáva na slučku; slizké, ak včelstvo siaha po slučke; tvrdé, ak je súčasťou včelstva nie je zachytený slučkou, môže byť odstránená iba celá kolónia).

Pri prezeraní náterov sa zistí, že kolónia je reprezentovaná jedným typom mikróbov, preto je možné izolovať čisté kultúry baktérií. Za týmto účelom sa zo študovaných kolónií uskutoční opätovné vysiatie na šikmý agar. Pri opätovnom výseve z kolónií je potrebné dbať na to, aby ste vzali presne zamýšľané kolónie bez toho, aby ste sa dotkli slučky blízkych kolónií. Skúmavky sú označené a inkubované v termostate pri 37 °C počas 24 hodín.

Tretia etapa výskumu. Identifikácia izolovanej kultúry. Identifikácia mikróbov - určenie systematickej polohy kultúry izolovanej z materiálu k druhu a variantu. Prvou podmienkou spoľahlivosti identifikácie je bezpodmienečná čistota kultúry. Na identifikáciu mikróbov sa používa súbor znakov: morfologické (tvar, veľkosť, prítomnosť bičíkov, toboliek, spór, relatívna poloha v nátere), tinktoriálne (vzťah k farbeniu podľa Grama alebo iné metódy), chemické (pomer guanín + cytozín v molekula DNA), kultúrna (požiadavky na živiny, kultivačné podmienky, rýchlosť rastu a príroda na rôznych živných médiách), enzymatická (štiepenie rôzne látky s tvorbou medziproduktov a finálnych produktov), ​​sérologické (antigénna štruktúra, špecifickosť), biologické (virulencia pre zvieratá, toxigenita, alergénnosť, účinok antibiotík a pod.).

Pre biochemickú diferenciáciu schopnosť baktérií fermentovať sacharidy s tvorbou medziproduktov a konečné produkty, schopnosť degradovať proteíny a peptóny a študovať redoxné enzýmy.

Na štúdium sacharolytických enzýmov sa izolované kultúry naočkujú do skúmaviek s polotekutým médiom obsahujúcim laktózu, glukózu a iné sacharidy a viacsýtne alkoholy. Na polotekutom médiu sa očkovanie uskutočňuje injekciou do hĺbky média. Pri výseve injekciou sa skúmavka s médiom drží pod uhlom, zátka sa odstráni a okraj skúmavky sa spáli. Materiál sa odoberá sterilnou slučkou a prepichne sa ňou stĺpec živnej pôdy takmer až po dno.

Na stanovenie proteolytických enzýmov sa izolovaná kultúra naočkuje peptónovou vodou alebo MPB. Aby to urobili, zoberú skúmavku s očkovaním bližšie k sebe a skúmavku s médiom - ďalej od seba. Obe skúmavky sa otvoria súčasne, pričom sa ich zátky zachytia malíčkom a okrajom dlane, okraje skúmaviek sa spália, kalcinovanou ochladenou slučkou sa zachytí trochu kultúry a prenesie sa do druhej skúmavky, rozotrie sa v kvapalné médium na stene skúmavky a zmyté médiom.

Pri sejbe a opätovnom sejbe by sa mala venovať pozornosť dodržiavaniu pravidiel sterility, aby sa ich plodiny nekontaminovali cudzou mikroflórou a tiež neznečisťovali životné prostredie. Skúmavky sa označia a umiestnia sa do termostatu na inkubáciu pri 37 °C počas jedného dňa.

Záver

Účtovanie výsledkov. Záver výskumu. Zohľadnia sa výsledky identifikácie a na základe súhrnu získaných údajov, na základe klasifikácie a charakteristík typových kmeňov opísaných v príručke (Bergyho príručka, 1994-1996) sa určí typ izolovaných kultúr.

"

Kultúrna metóda-vylučovanie a hromadenie čistej kultúry tank-th s jej posledným. Identifikátor.Niektorá.nádrž-a oblasť odporu, takže analýza nádrže môže obsahovať definíciu citlivosti. Pure-to-ry na \ b

Vlastnosť: viacstupňová. Mínus - trvanie.

Dobre skúmajte: krv, moč, cerebrospinálnej tekutiny hlien z hrdla a nosa, výkaly

Na izoláciu použite husté médium Etapy: izolácia čistej kultúry

Metódy predbežnej klasifikácie:

1) morf.analýza bakteriálnych kolónií a ich charakteristiky na špeciálnych \diferenciálnych médiách

2) mikroskop - zafarbil som nádrž

Pre konečnú identifikáciu nádrže: štúdia b \ x akty (biotypizácia);

detekčná nádrž Ag (sérotyp-e) -1) r-tion aglutinácia na skle-pr. pre enterobaktérie

2) imunodiff v agare (corinebac-ii diftéria)

def-e citlivosť na bakteriofágy (fág typu e)

IMUNOLOGY

Receptory rozpoznávajúce antigén na lymfocytoch.

Porovnávacie charakteristiky BCR a TCR

B bunkový receptor (BCR)			T bunkový receptor (TCR)
1. Štruktúra
Membránový IgM (mIgM), menej často IgD monomér s ďalšou hydrofóbnou doménou na ukotvenie na plazmatickú membránu (špecifickosť 2 paratopov je rovnaká ako u secernovaných protilátok)	Heterodimér, pozostáva z 2 glykopeptidových reťazcov - α a β (pripojený disulfidovou väzbou). Každá pozostáva z 2 funkčne odlišných častí - premenlivý a konštantný Variabilné oblasti (domény) oboch reťazcov formulár antigén viažuce centrum TCR (paratop CDR 1-3). Konštantné fragmenty α,β reťazcov poskytujú fixácia TCR na plazmatickej membráne a kontakty s kostimulačnými molekulami
2. Mechanizmus amplifikácie antigénneho signálu funkčne závisí od
CD79a a CD79b		Reťazce TCR sú exprimované na bunkovej membráne iba v kombinácii s CD3
Ani po rozpoznaní a naviazaní voľného antigénu alebo komplexu MHC-proteín nie je dostatok signálu na aktiváciu lymfocytov. Vyžaduje sa interakcia s ďalšími molekulami. Ich cytoplazmatické fragmenty sú spojené s intracelulárnymi enzýmami (tyrozínkinázami), ktorých aktivácia spúšťa kaskádu vedúcu k expresii génov. To vyvoláva proliferáciu a diferenciáciu naivných buniek na efektorové a pamäťové bunky.
Receptorový komplex naivných lymfocytov
BCR komplex = mIgM+CD79a+CD79b		TCR komplex = TCR+CD3+CD4/8
3. Prítomnosť sekrečnej formy
Áno (voľný imunoglobulínový pentamér)		Nie (nevylučuje sa extracelulárne)
4. Mechanizmus rozpoznávania antigénu (Hlavná prednosť)!!!
Rozpoznať epitop priamo "bez sprostredkovateľov"		zadarmo epitopy nevnímané Princíp dvojitého uznania Len v kombinácii s molekulouMHC na povrchu vlastného agropriemyselného komplexu HLA obmedzené(Pozri nižšie)
5. Zmena v priebehu imunogenézy
1. Zmena izotypu receptora na IgG, IgA a IgE v dôsledku zmeny triedy vylučovaných protilátok (t.j. po krátkom IgM vzplanutí začnú dominovať IgG protilátky). Pri opakovanom kontakte s antigénom už od začiatku prevládajú protilátky IgG, keďže receptory v pamäťových bunkách sú od začiatku zastúpené najmä molekulami IgG. 2. Zvýšená afinita		1. Žiadna zmena, stabilný izotyp 2. Afinita je konštantná
6. Podobnosť: klonovaný citlivosťou na antigén (rozpoznanie antigénnych epitopov) Každý lymfocyt má receptory jedno špecifikum(jeden idiotyp, t.j. klonovaný V-doménami) t.j. sa líšia v lymfocytoch reagujúcich na rôzne antigény

2. Pojem „klonovanie“ v imunológii znamená:

1. Schopnosť každého B/T-lymfocytu reagovať na jeden antigén (epitop). 2. Schopnosť každého B/T-lymfocytu reagovať na niekoľko epitopov. 3. Selektívna väzba antigénnych peptidov HLA molekulami buniek prezentujúcich antigén. štyri. Špecifickosť (epitopová komplementarita) receptorov lymfocytov rozpoznávajúcich antigén. 5. Klonošpecifickosť CD fenotypu T a B lymfocytov.

Lymfocyty sú heterogénne vo svojej schopnosti rozpoznávať antigény a reagovať s nimi. Navyše, každý lymfocyt a jeho potomstvo (klon) sú naladené na interakciu s jediným antigénom (presnejšie epitopom). Inými slovami, lymfocyty sú klonované citlivosťou na antigény, a to je to, čo určuje selektivitu (antigénnu špecifickosť) imunitnej odpovede. Molekulárnym základom klonovania je špecifickosť receptorov, ktoré viažu antigény: receptory každého klonu sú jedinečné a reagujú len s jedným antigénom. To znamená, že počet klonov a receptorov špecifických pre líniu musí byť enormný, čo zodpovedá nekonečnému počtu potenciálnych antigénov. Pred stretnutím s antigénom je každý klon reprezentovaný malým počtom zrelých pokojových buniek (nazývajú sa „naivné“). Väzbou na komplementárne receptory antigén zabezpečuje aktiváciu lymfocytu, ktorý pôsobí ako selekčný faktor (výber klonov). Počet klonov sa zvyšuje (rozšírenie klonu) a jeho základné lymfocyty sa diferencujú na efektorové bunky a pamäťové bunky.

BAKTERIOLÓGIA

3. Príznaky Mycobacterium tuberculosis spojené s charakteristikami ich bunkovej steny:

1. Odolnosť voči kyselinám. 2. Pomalá miera reprodukcie. 3. Odolnosť voči fagocytom. 4. Stabilita vo vonkajšom prostredí. 5. Vysoká citlivosť na antibiotiká.

TUBERKULÓZA. rod Mycobacterium Generický znak - odolnosť voči kyselinám, alkoholom a zásadám. čeľaď Mycobacteriaceae (saprofyty) oddelenie Firmicutes. Nepohyblivé, aeróbne gr + tyčinkovité baktérie. Niekedy tvoria štruktúry pripomínajúce mycélium, odtiaľ názov. Na farbenie sa používa metóda Ziehl-Neelsen. Ochorenie je spôsobené 3 typmi mykobaktérií: Mycobacterium tuberculosis - ľudský druh, Mycobacterium bovis - hovädzí druh, Mycobacterium africanum - stredný druh. [Pôvodcovia mykobakteriálnych antroponóz: M. leprae, m. tuberculosis. pôvodca mykobakteriálnej zoonózy: M.bovis.] rezervoár - chorý, cesta infekcie - aerogénny. Výskyt sa zvyšuje v dôsledku zlej hygieny atď. Kochova prútik je tenká, rovná alebo mierne zakrivená, náchylná na vetvenie. Metóda Ziehl-Neelsen farbí do červena, obsahuje kyslé zrnká (zrnká muchy v cytoplazme).Potrebné sú rastové faktory. V tekutých médiách syntetizuje faktor kordu, faktor virulencie. Syntetizuje veľa kyseliny nikotínovej - niacínu (niacínová testovacia metóda sa líši mikobakt). Lipidy bunkovej steny: mykolové kyseliny, kordový faktor, mykozidy, sulfatidy. Preto je odolná voči kyselinám, je to „obrnené monštrum“. odolnosť voči fagocytom. stabilný v prostredí. Faktory antifagocytárnej aktivity: lipidy bunkovej steny, siderofory.

Patogenéza: prienik do alveol; reprodukcia v alveolárnych makrofágoch (inhibícia fagozomálno-lyzozomálnej fúzie pupočníkovým faktorom); vytvorenie nešpecifického preimunitného granulómu (štruktúra vytvorená okolo infikovaných buniek z makrofágu); prenikanie baktérií do regionálnych lymfatických uzlín; indukcia imunity T-buniek; T-dependentná aktivácia makrofágov (najprv Thelp, zvýšenie biocidity infikovaných makrofágov, potom Tkil, zničenie infekcie makrofágov); vznik špecifického postimunitného granulómu. Dokončenie procesu - fibróza, kalcifikácia, tvorba latentných infekcií, formy imunity voči exogénnej reinfekcii. [Iniciácia procesu - intramakrofágová invázia. Mechanizmy: neagresívna fagocytóza, potlačenie tvorby fagolýzou, aktívna opozícia voči biotoxickým faktorom fagolyzozómov, potlačenie funkčnej spolupráce medzi makrofágmi a T-lymfocytmi.] Primárna tuberkulóza-výhoda v detskom prejave (+ subfeb temp) - Primárny imunitný komplex - zameranie Gon. V granulóme sú bunky Pirogov-Lnghans, pozdĺž obvodu - lymfocyty, mononukleárne bunky. Je možná reaktivácia endogénneho inf (sekundárna trubica) alebo exogénu, reinfekcia je zriedkavá, vyvíja sa na pozadí alergie na tuberkuloproteíny.U imunokompromitovaných jedincov je možná diseminovaná tuberkulóza. Tuberkulín je komplex tuberkuloproteínov (proteínových derivátov) používaných v diagnostike alergie. [Používa sa Freundovo adjuvans: peptidoglykán + lipidy bunkovej steny]. Tuberkuloproteíny majú imunologicky závislú patogenitu, podieľajú sa na realizácii ochrannej imunity a využívajú sa v diagnostike alergie. Lipidy bunkovej steny: antimakrofágová aktivita, podieľajú sa na indukcii imunity T-buniek ako adjuvans, určujú kultúrne a tinktoriálne charakteristiky baktérií. Hlavná funkcia makrofágov v zóne nešpecifický granulóm: excitácia reakcií bunkovej imunity. Postimunitný granulóm: vzniká na pozadí hypersenzitívnej reakcie oneskoreného typu na tuberkuloproteíny, zóna pre funkčnú spoluprácu medzi makrofágmi a T-efektormi, základ pre deštruktívne reakcie, základ pre sanogenézu (zotavenie), končí asymptomatickou perzistenciou patogén. Deštruktívne procesy pri tuberkulóze sú determinované: imunologicky sprostredkovanými účinkami mycobacter AG, cytokín-dependentnou aktiváciou makrofágov, alergiou na tuberkuloproteíny. Imunita Protituberkulózna imunita nesterilná infekčná, [v dôsledku prítomnosti L-foriem mykobaktérií v organizme.] bunková, antibakteriálna

Laboratórna diagnostika Medzi povinné vyšetrovacie metódy patrí bakterioskopické, bakteriologické vyšetrenie, biologický test, tuberkulínová diagnostika, založená na stanovení precitlivenosti organizmu na tuberkulín (zmes bielkovín sa čistí tuberkulínom). Častejšie na zistenie infekcie a alergické reakcie vykonajte intradermálny Mantoux test s purifikovaným tuberkulínom v štandardnom riedení (do 14 rokov). Fluorografia. Liečba-antibiotická terapia, zasiahne chirurg.

Špecifická profylaxia sa uskutočňuje zavedením živej attenuirovej vakcíny - BCG (BCG), intradermálne na 5. deň po narodení dieťaťa. Následné preočkovania sa vykonávajú 7, 13 rokov.

VIROLÓGIA

4. Hemaglutinín ortomyxovírusov:

1. Iniciuje interakciu vírusu s bunkou. 2. Aktivuje sa po obmedzenej proteolýze. 3. Faktor zlúčenia. 4. Ochranný antigén. 6. Dostupné vo všetkých typoch (druhoch) rodu Influenza.

ortomyxovírusy Rod Influenzavirus z čeľade orthomixoviridae (hlien, tie s afinitou k mucínu). Existujú 3 typy - A, B, C. "-" RNA (8 segmentov, jednovláknová je A a B, 7 pre C) Takáto segmentácia umožňuje dvom vírusom jednoduchú výmenu genetických informácií počas interakcie a tým prispieva k vysokej variabilite vírusu., helikálny nukleokapsid (zložený z RNA, nukleoproteínu (štruktúry a regulujú úlohu a typovo špecifický ag) a proteínu), superkapsid-is (= "komplex"). Proteíny (enzýmy) komplexu RNA polymerázy: PB1 proteín (transkriptáza), PB2 proteín (endonukleáza), PA proteín (replikáza). Ďalej prichádza M-proteín (zúčastňujúci sa na zostavovaní vírusových častíc, typovo špecifický AG), potom bilipidová vrstva (pôvodná z membrány hostiteľskej bunky, pocity pre éter), z ktorej vyskakuje glykoproteín, pozostávajúci z hemaglutinínu (H ) a neurominidáza (N (typ C nie ona))

Štruktúra AG: vnútorná - NP, proteín-M, proteíny komplexu RNA polymerázy. Vonkajšie - H (odroda 15, u ľudí: H1-3) a N (9, u ľudí: N1, N2). Replikácia h/z mRNA.

(transkriptáza, endonukleáza, replikáza). Repl v jadre a syntéze

Endocytózou hz H do endozómu tam kyslé prostredie mení konformáciu, obnažuje peptidy (F-proteíny) spôsobujúce fúziu vírusovej a fagolyzozomálnej membrány => deprotenizácia

Drift, posun. virémia. Remantadin.

Znaky: -RNA (=> nemôže vykonávať funkcie mRNA bez transkripcie, fragmentárna), škrupina (vnútorná patrí M-proteín, nukleoprote, fermový polymérny set), excitácia akútnych respiračných infekcií, nukleokapsidová helix sim. Rozdeľte na typy: (A, B, C) AG-druhy vnútorných bielkovín (nukleoproteín). A, B, C sa líšia v: ekológ, škála AH-izmu, spektrum viriónových fariem, krok Epidem-ti (lídrom v patogénoch je vírus typu A, typ B je intermediárny, typ C je príčinou tzv. sporadické ohniská). Proteíny Supercaps: N, H. H: iniciovanie interakcie vir s CL (TK má vďaka tomu afinitu k sialylovaným glykopeptidom a glykolipidom, virióny sú fixované na plazmatických membránach), aktivované proteolýzou (syntéza vo forme a metóda prekurzorovej mačky reaguje s preskripčnou bunkou, ale nie aby sa zabezpečila fúzia oboloviriónu s membránovými bunkami => musí prejsť obmedzenou proteolýzou, proteázy štiepia hemaglut na H1 a H2 a po dodatočnej konformácii v kyslom prostredí endozómov H2 iniciuje tzv. fúzia), f-r fúzia (spôsob uvoľnenia nuklekapsidu do cytoplazmy: v kyslom prostredí endozómov sa im odkryje špeciálna štruktúra hemaglut (miesta fúzie) mačka excitabilné kombinované vírusové a bunkové membrány), protect-AG (blokujú vírus na ňu a potlačiť infekciu), pri všetkých typoch chrípky. štiepenie kyseliny sialovej z glykolepidov a glykopeptidov, ktoré v podstate inaktivujú receptory pre hemaglutinín), rozdiely medzi epitopmi sú variabilné. AG-posun (toto je posun, neočakávaná, náhla mačka vedie k úplnej zmene antigénu profil H,N a objavili sa nové podtypy: len typ A, ekologický determinant-n (viažuce vírusy na dýchacie cesty), genetický determinant (závisí od genetickej rekombinácie génov pri infikovaní buniek viacerými kmeňmi súčasne), zmena podtypov viriónu proteín pov, pandémia (H1N1 (toto je španielsky) H3N2 (hongkongský vírus) získať: AG-zmena, drift.

Lístok na skúšku 58.

VŠEOBECNÁ MIKROBIOLÓGIA

Koncept špecifická prevencia infekčné choroby. Imunologické základy očkovania. Diela E Jennera a L. Pasteura. Typy vakcín (usmrtené, živé, podjednotkové; mono- a asociované). Rekombinantné vakcíny, princíp získavania. konjugované vakcíny. Slizničné vakcíny.

Imunita je pasívna (1. prirodzene získaná po infekcii a 2. umenie získaná po vakcíne) a aktívna (1. prirodzene získaná AT matky cez mlieko alebo placentu a 2. umenie získaná séroterapiou). Nešpecifická prof-ka je zameraná na vyhnutie sa infekcii a špecifická je zameraná proti konkrétnej excitácii. Podstatou očkovania je vytvorenie spomienky na hypertenziu, ktorá zabezpečí rýchlu imunitnú odpoveď. Pre vakcínu sú potrebné iba ochranné antigény (t. j. tie, ktoré spôsobujú tvorbu protilátok)

HISTÓRIA: V roku 1778 Jenner dokázal, že očkovanie proti „kravským kiahňam“ chránilo pred nákazou pravými kiahňami. Bol to produkt čistého experimentovania. Toto je dátum narodenia vakcinológie. Pojem „vakcína“ vymyslel Pasteur. V roku 1881 „zámerne“ oslabil virulenciu baktérií ich kultiváciou v nepriaznivom stave. Pripravil prvé vakcíny proti slepačej cholere a antraxu. V roku 885 dostal vakcíny proti besh-wa (neskôr sa ukázalo, že to bola zabitá vakcína)

Typy vakcín:

1. NAŽIVO - zaviesť oslabené (oslabené) baktérie. Osl-t fyzikálne, chemické metódy. "+" - vysoká imunogenicita a trvanie účinku (pretože oslabené baktérie sú schopné expandovať v org-me, pretrvávať "-" - zvýšená reaktogenita, nestabilita, zanedbateľné. Ale pravdepodobnosť reverzie virulentného fenotypu. Príklad: BCG

2. KILLED-sod-t inaktivované bact, prost, huby alebo virióny. Ich nevýhody a výhody sú opakom živých vakcín. Treba to robiť častejšie. Príklad: n-chrípka, brušný týfus

3. PODJEDNOTKA – pozostáva z purifikovaných ochranných antigénov. Reaktivita je minimálna. Nízka imunogenicita zvýšená pomocou adjuvans

1) Konjugovaný - isp-t na vytvorenie imm-že proti T-nezávislej AG. T-independent AG nezanecháva pamäť.

2) Anatoxíny – neutralizované toxíny baktérií. Problém je, že monointoxikácia je zriedkavá. Exotoxíny sú ošetrené formalínom a strácajú svoje toxické vlastnosti, ale ich imunita zostáva. Nechránia pred baktériami. Príklad: tetanový toxoid

3) Rekombinantné - ide o rekombinantné molekuly DNA, vyrobené na báze bakteriálnych plazmidov, do ktorých sú vložené gény ochranných antigénov. Takýto DNA synth-t AG, indukujúci humorálnu a bunkovú imm.

1) Nahé s použitím voľných plazmidov alebo plazmidov adsorbovaných na nosičoch. Sú bezpečné. Príklad: Hepatitída B

2)Vektor - na doručenie použite oslabený bakt

4. MUCOSALE - vytvorený špeciálne pre imm-že sliznice proti infekciám dýchacích, črevných a pohlavných ciest. Pomiso d-I na mieste, ovplyvňujú aj celkový imm-t. Ich nutne sopr-t adjuvans. Ich zavádzanie do praxe je ale veľmi pomalé.

Bakteriologická výskumná metóda. Izolácia čistej kultúry aeróbnych baktérií (1-2 stupne)

1. Podstata bakteriologickej metódy

3. Spôsoby získania izolovaných kolónií

4. Spôsoby získania čistej kultúry

1. Vykonajte primárny výsev Kochovou a Drygalského metódou

2. Izolujte čistú kultúru

Pracovný plán:

1. Bakteriologická výskumná metóda

2. Etapy bakteriologickej metódy

3. Koncept: čistá kultúra, kmeň, kolónia

4. Spôsoby získania izolovaných kolónií

5. Spôsoby získania čistej kultúry aeróbnych baktérií

Hlavnou metódou laboratórnej diagnostiky infekčných ochorení je bakteriologická metóda. Podstatou bakteriologickej metódy je izolácia patogénov zo skúmaného materiálu a jeho identifikácia (definícia rodu, druhu, odrôd).

Bakteriologická metóda vám umožňuje určiť:

1. Typ patogénu a stanovenie diagnózy ochorenia

2. Antibiotiká, ktoré zabíjajú patogén a predpisujú vhodnú liečbu

3. Fagovary a sérovary patogénu na identifikáciu zdroja infekcie

Prvým stupňom je primárna inokulácia testovaného materiálu na získanie izolovaných kolónií. Primárny výsev sa vykonáva na pamäťové médiá a DDS (pohárové médiá).

Druhou fázou je charakterizácia izolovaných kolónií a získanie čistej kultúry z nich presadením na šikmý stĺpec hlavného média.

Treťou etapou je identifikácia čistej kultúry – určenie rodu, druhu, odrôd patogénu, stanovenie citlivosti na antibiotiká, stanovenie fagovarov.

Kultúra mikroorganizmov sú baktérie pestované na živných médiách. Čistá kultúra je jeden druh baktérií pestovaných na živných médiách. V rámci druhu existujú odrody, ktoré sa líšia v jednom znaku:

1. Morfovary – líšia sa morfológiou

2. Chemovary – líšia sa biochemickými vlastnosťami

3. Sérovary – líšia sa antigénnymi vlastnosťami

4. Fagovary – líšia sa citlivosťou na fágy

Čistá kultúra je potrebná na identifikáciu, stanovenie sérovarov, fagovarov, citlivosti na antibiotiká. Kmeň je jeden druh baktérie izolovaný zo špecifického zdroja (rieka Volga, chorý Ivanov atď.). Kolónia - viditeľná akumulácia baktérií rovnakého druhu, vytvorená počas reprodukcie jednej bakteriálnej bunky na hustom živnom médiu.

Prvým stupňom štúdie je primárna inokulácia testovaného materiálu na získanie izolovaných kolónií. Pred počiatočnou inokuláciou sa vykoná mikroskopia testovaného materiálu. Testovaný materiál zvyčajne obsahuje zmes rôznych baktérií vrátane patogénov. Na izoláciu patogénu je potrebné získať izolované kolónie (baktérie rovnakého druhu) výberom živného média a použitím špeciálnych metód výsevu.

Existujú dva spôsoby získania izolovaných kolónií:

1. Drygalského metóda

Bakteriologická metóda štúdia patologického materiálu na izoláciu a identifikáciu mykobaktérií zahŕňa 3 metódy: bakterioskopickú, kultúrnu a biologickú / R.V. Tkzova, 1983; I. I. Rumachik, 1987, 1993; A.S. Dončenko, 1989; Yu.Ya. Kassich, 1990; A. Kh. Naimanov, 1993; L. P. Khodun, 1997/. Doba bakteriologického vyšetrenia by nemala presiahnuť 3 mesiace.

Vzhľadom na to, že makroskopické tuberkulózne zmeny v orgánoch a tkanivách veľkého dobytka vyvoláva pôvodcu tuberkulózy hovädzieho dobytka, nemá zmysel skúmať takýto materiál bakteriologicky. Ak je takýto materiál dodaný do laboratória na výskum, vykoná sa komisionálna kontrola a vypracuje sa zákon. Materiál je zdravotne nezávadný.

Bakterioskopické (mikroskopické) vyšetrenie materiálu spočíva v tom, že sa z každého orgánu (alebo kúskov orgánu s podozrivými zmenami pri tuberkulóze) a lymfatickej uzliny dodanej na vyšetrenie vyrobia 2 odtlačkové stery, vysušia sa na vzduchu, zafixujú sa nad plameňom. alkoholová lampa, farbenie podľa Cyl-Nielsena a prezeranie zafarbených náterov pod mikroskopom s najmenej 50 zornými poľami v každom nátere. Z hmoty z jedného korpusu je potrebné pripraviť minimálne 20 nátierok-tlačov. Okrem toho sa zo suspenzie materiálu vysiateho na živné pôdy pripravujú nátery pre mikroskopiu.

Farbenie náterov podľa Ziehla-Neelsena je selektívne na detekciu mykobaktérií: na modrom pozadí zafarbených tkanív alebo vonkajšej mikroflóry sú mykobaktérie viditeľné ako červené, ružové alebo rubínovo-červené tyčinky. Najlepšie je prezerať šmuhy pod binokulárnym mikroskopom pri zväčšení 1,5 (dýza) x 7 (okulár) x 90 alebo 100 (objektív).

Metóda sa používa ako signál, pretože prítomnosť alebo neprítomnosť mykobaktérií v náteroch vôbec neovplyvňuje priebeh. daľší výskum a ani pozitívny bakterioskopický záver nemá právny význam (okrem vtákov). Materiál je potrebné ďalej skúmať.

Laboratórna diagnóza tuberkulózy u vtákov sa považuje za stanovenú, ak sa z testovaného materiálu izoluje kultúra vtáčích mykobaktérií (z papagájov – ľudských alebo vtáčích druhov), pozitívny výsledok biotesty, ako aj pri detekcii mykobaktérií v náteroch z patologického materiálu pri mikroskopickom vyšetrení (bod 7.3.2. príručky).

Je potrebné dbať aj na to, že príprava náterov odtlačkov, ich fixácia a prezeranie si vyžaduje veľa času a je veľmi zriedkavé v nich odhaliť mykobaktérie, dokonca aj v náteroch zo suspenzie osiva. Preto, aby sme ušetrili pracovný čas a peniaze pri štúdiu materiálu zo zvierat, u ktorých nedošlo pri porážke k zmenám, je vhodné obmedziť sa na prípravu a prezeranie náterov len zo suspenzie materiálu vysiateho na živných pôdach. To nepovedie k poškodeniu pri diagnostike tuberkulózy, pretože štúdium materiálu pokračuje ďalej.

Okrem bežnej svetelnej mikroskopie možno použiť fluorescenčnú mikroskopiu. Nátery sa pripravujú rovnakým spôsobom, fixujú sa a farbia zmesou fluorochrómov. Zafarbené šmuhy sa prezerajú pod fluorescenčným mikroskopom. Metóda je citlivejšia, ale menej špecifická, a preto nie je veľmi prijateľná najmä v praktických laboratóriách.

Kultúrna izolácia mykobaktérií na živných médiách je jedným z dôležitých spojení v laboratórna diagnostika tuberkulóza v súčasnom štádiu. Živné médiá, na ktoré bol materiál zasiaty (pre 5 až 10 skúmaviek v súlade s pokynmi) v prvých 2 až 3 týždňoch, však spravidla čiastočne alebo úplne klíčia v dôsledku porušenia sterility počas očkovania. materiálu. Plodiny sa vyhadzujú práve v čase, keď je najpravdepodobnejší výskyt počiatočného rastu atypických mykobaktérií (nehovoriac o prejave počiatočného rastu pôvodcu tuberkulózy, ktorý rastie aj neskôr). V takýchto prípadoch mechanicky vypadáva kultivačná metóda izolácie mykobaktérií na živných médiách. To je jeden z hlavných dôvodov na získanie negatívnych výsledkov pri bakteriologickom vyšetrení materiálu. V dôsledku toho, že po naočkovaní materiálu nedošlo k rastu kolónií mykobaktérií na živnom médiu a laboratórne zvieratá zostali nažive 3 mesiace, štandardná odpoveď laboratórií je nasledovná: „Pôvodca tuberkulózy nie je izolovaný“ alebo „ Vyšetrenie materiálu na tuberkulózu je negatívne“. Na základe výsledkov štúdií nebol stanovený dôvod reakcie hovädzieho dobytka na tuberkulín, čo vedie k ďalšiemu neodôvodnenému zabíjaniu značného počtu zvierat, ktoré reagovali na tuberkulín na farmách bez výskytu tuberkulózy hovädzieho dobytka, ktorá spôsobuje veľké ekonomické škody, narúša obrat a reprodukciu stáda.

Vzhľadom na uvedené je potrebné uprednostniť kultivačný spôsob izolácie mykobaktérií z materiálu na živných pôdach, ako najslabší článok bakteriologickej diagnostiky tuberkulózy v obvodných veterinárnych laboratóriách.

Pozitívne výsledky kultivačnej metódy izolácie mykobaktérií závisia najmä od dvoch okolností: od zvýšenia spoľahlivosti výsevu mykobaktérií z materiálu a od dodržania podmienok sterility pri práci v boxe.

Zvýšenie spoľahlivosti výsevu mykobaktérií z materiálu odobratého na štúdiu závisí predovšetkým od jeho kvalitatívneho výberu, predsejbovej úpravy a zvýšenia počtu skúmaviek média, na ktoré sa výsev vykonáva.

Hlavné podmienky, ktorých dodržiavanie pri výseve materiálu na živné médiá zaručuje rast kolónií mykobaktérií:

a) odobrať materiál na bakteriologické vyšetrenie zo zabitých zvierat, u ktorých nedošlo počas porážky k zmenám, oddelene z každého jatočného tela a každú vzorku (materiál z každého zvieraťa) naočkovať do 10-20 skúmaviek s médiom podľa nasledujúcej schémy:

Lymfatické uzliny hlavy (submandibulárne, hltanové);

Bronchiálne a mediastinálne lymfatické uzliny;

Mezenteriálne (mezenterické) lymfatické uzliny;

Iné lymfatické uzliny (ak existujú podozrivé oblasti);

Orgány (aj v prípade potreby).

Výsledkom je naočkovanie materiálu z jedného zvieraťa pre 30-50 skúmaviek média. Tým sa dosiahne 3- až 5-násobné zvýšenie spoľahlivosti výsevu mykobaktérií, keďže bez separácie vzoriek (podľa návodu) sa odporúča naočkovať materiál len na 5 až 10 skúmaviek média z dvoch hláv jednej farma.

b) Priamo pri bakteriologickej inokulácii materiálu vyrežte kúsky s narušenou morfologickou štruktúrou lymfatickej uzliny alebo orgánu (hyperplázia, indurácia, bodové a pruhované krvácanie a pod.). Okrem toho je potrebné vystrihnúť všetky zmenené oblasti. Ak je v jednej malte veľa materiálu podľa objemu, potom sa môže rozdeliť na dve.

c) Dôsledne dodržiavať metodiku práce, bez porušenia spôsobu spracovania a výsevu materiálu.

d) Pri homogenizácii materiálu, najmä lymfatických uzlín, je potrebné použiť sterilný piesok alebo jemne rozbité sterilné sklo. Pre lepšiu extrakciu mykobaktérií z testovaného materiálu materiál čo najviac rozdrvte (na krémovú konzistenciu).

e) K homogenizovanému materiálu v mažiari pridajte soľný roztok v množstve potrebnom na naočkovanie suspenzie materiálu na živné médiá a na biotest (v priemere do 0,5 cm3 v jednej skúmavke a 1-2 cm3 pri subkutánnej infekcii jedno morča). Toto množstvo fyziologického roztoku je možné vypočítať vopred.

f) Kontrola úrody materiálu by sa mala vykonávať po 3, 5, 7, 10, 15 dňoch a potom raz týždenne.

g) Akákoľvek kolónia mikroorganizmov rastúca na médiu (typická alebo atypická, pigmentovaná alebo nepigmentovaná, slizovitá alebo suchá atď.) sa musí mikroskopovať so selektívnym farbením podľa Ziehl-Neelsena.

Je potrebné venovať pozornosť stupňu premytia materiálu od kyseliny (alebo zásady), ktorý sa používa na ošetrenie materiálu pred kontamináciou cudzou mikroflórou. Zvyšková kyselina bude vždy prítomná v suspenzii zo semenného materiálu, mala by sa však obmedziť na minimum. Indikátorom toho je obnovenie pôvodnej farby média na 2.-4. deň po zasiatí materiálu. Ak sa farba média neobnoví, znamená to zvýšené množstvo zvyškovej kyseliny. Farba média nadobúda modrastý odtieň rôznej intenzity. Rast (predpokladaných) mykobaktérií sa v tomto prípade spomalí, prípadne nebude existovať vôbec, najmä pôvodca tuberkulózy, keďže je náročnejší na kultivačný režim. Zvyškové množstvo kyseliny pôsobí na mykobaktérie do určitej miery bakteriostaticky.

Na utesnenie skúmaviek po naočkovaní materiálu možno použiť bavlnené a bavlnené zátky s následným plnením parafínovými, bezgumovými a gumenými s vyrezanou šikmou drážkou, kortikálnymi a kovovými zátkami (uzávermi).

Pri určovaní druhovej príslušnosti izolovanej kultúry mykobaktérií je známych veľa (asi 300) rôznych testov: kultúrno-morfologické, biologické, biochemické, sérologické, determinačné. liekovej rezistencie atď. Vo veterinárnej praxi sa však používa ich minimum (pozri návod). Pre laboratóriá stačí stanoviť izolovanú kultúru mykobaktérií týchto druhov: hovädzie, ľudské a vtáčie, ktorá sa stanoví biotestom a atypické mykobaktérie - rozdelené do skupín podľa Runyona (1959): I - fotochromogénne (tvoriace pigment pod vplyvom svetla), II - skotochromogénne (tvoriace pigment bez ohľadu na vystavenie svetlu - v tme aj na svetle), III - nechromogénne (netvoriace pigment) alebo sa nazývajú aj nepigmentové (tzv. patrí sem aj pôvodca vtáčej tuberkulózy), IV - rýchlo rastúce mykobaktérie a kyselinovzdorné saprofyty.

Na tento účel je celkom efektívne a ekonomicky opodstatnené študovať vlastnosti izolovanej kultúry podľa skrátenej schémy, v ktorej sa hlavná pozornosť venuje načasovaniu výskytu primárneho rastu kolónií, tvorbe pigmentu, kultúre- morfologické a farbiace vlastnosti pri farbení Ziehl-Neelsen. Zvlášť významný je test na tvorbu kordu v primárnej alebo dokonca subkultúre v kombinácii s výsledkami biotestu. Na prípravu náterov z vyrastených kolónií je vhodné robiť ich súčasne z kolónií aj zo zvyškov suspendovaných látok a kondenzátu, t.j. z tekutej časti na dne skúmavky.

Pracovníci laboratória majú navyše možnosť nielen vykonávať kontrolné porážky zvierat, ktoré reagovali na tuberkulín a odoberať vzorky materiálu na výskum, ale aj počas života zvierat odoberať vzorky na bakteriologický výskum (bronchiálne resp. nosový hlien mlieko, výkaly, moč, exsudát, krv atď.), ako aj vzorky krmiva, vody, predmetov z prostredia na izoláciu mykobaktérií a tým nepriamo dokazujú príčinu reakcie dobytka na tuberkulín. Pri výseve prídavného materiálu a vzoriek z objektov životného prostredia sa využívajú známe metódy koncentrovania mykobaktérií: sedimentácia, flotácia, flotácia-sedimentácia a iné.

Skrátená schéma diferenciácie mykobaktérií pomocou biotestu