Fázy PCR. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) - metóda vysokej presnosti pri detekcii špecifických infekčných agens

Za primerané a účinnú liečbu mnohé infekčné choroby vyžadujú včasnú detekciu presná diagnóza. Pri riešení tohto problému sa dnes využívajú high-tech diagnostické metódy založené na metódach molekulárnej biológie. V súčasnosti je polymerázová reťazová reakcia (PCR) už široko používaná v praktickej medicíne ako najspoľahlivejší laboratórny diagnostický nástroj.

Čo vysvetľuje popularitu PCR v súčasnosti?

po prvé, túto metódu používa sa na identifikáciu patogénov rôznych infekčných chorôb s vysokou presnosťou.

Po druhé, sledovať účinnosť liečby.

V rôznych príručkách, prospektoch, článkoch, ale aj vysvetlivkách medicínskych špecialistov sa často stretávame s používaním nezrozumiteľných výrazov a slov. Je naozaj ťažké hovoriť o high-tech produktoch vedy obyčajnými slovami.

Aká je podstata a mechanika PCR diagnostiky?

Každý živý organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Gény sa nachádzajú v molekule DNA, ktorá je v skutočnosti „vizitkou“ každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) je veľmi dlhá molekula, ktorá sa skladá zo stavebných blokov nazývaných nukleotidy. Pre každý patogén infekčných chorôb sú umiestnené prísne špecifické, to znamená v určitom poradí a kombinácii. Keď je potrebné pochopiť, či má osoba konkrétny patogén, odoberie sa biologický materiál (krv, moč, sliny, náter), ktorý obsahuje DNA alebo fragmenty DNA mikróbov. Množstvo genetického materiálu patogénu je však veľmi malé a nie je možné povedať, ku ktorému mikroorganizmu patrí. Na vyriešenie tohto problému slúži PCR. Podstatou polymerázovej reťazovej reakcie je, že sa odoberie malé množstvo materiálu na výskum, ktorý obsahuje DNA, a počas procesu PCR sa množstvo genetického materiálu patriacemu konkrétnemu patogénu zvyšuje, a tak ho možno identifikovať.

PCR diagnostika je genetická štúdia biomateriálu.

Myšlienka metódy PCR patrí americkému vedcovi K. Mullinsovi, ktorý navrhol v roku 1983. Široké klinické využitie však získal až v polovici 90-tych rokov XX storočia.

Poďme sa zaoberať terminológiou, čo to je - DNA atď. Každá bunka akejkoľvek živej bytosti (zviera, rastlina, človek, baktérie, vírus) má chromozómy. Chromozómy sú správcami genetickej informácie, ktorá obsahuje celú sekvenciu génov každej konkrétnej živej bytosti.

Každý chromozóm sa skladá z dvoch reťazcov DNA, ktoré sú navzájom stočené do špirály. DNA je chemicky deoxyribonukleová kyselina, ktorá pozostáva z konštrukčné komponenty- nukleotidy. Existuje 5 typov nukleotidov – tymín (T), adenozín (A), guanín (G), cytozín (C) a uracil (U). Nukleotidy sú usporiadané jeden po druhom v prísnej individuálnej sekvencii a tvoria gény. Jeden gén môže pozostávať z 20-200 takýchto nukleotidov. Napríklad gén kódujúci produkciu inzulínu má dĺžku 60 párov báz.

Nukleotidy majú vlastnosť komplementarity. To znamená, že opačný adenín (A) v jednom reťazci DNA je vždy tymín (T) v druhom reťazci a opačný guanín (G) - cytozín (C). Schematicky to vyzerá takto:
G – C
T - A
A - T
Táto vlastnosť komplementarity je kľúčová pre PCR.

Okrem DNA má rovnakú štruktúru aj RNA – kyselina ribonukleová, ktorá sa od DNA líši tým, že namiesto tymínu používa uracil. RNA - je nositeľkou genetickej informácie v niektorých vírusoch, ktoré sa nazývajú retrovírusy (napríklad HIV).

Molekuly DNA a RNA sa môžu „množiť“ ( daný majetok používané na PCR). Deje sa to nasledovne: dve vlákna DNA alebo RNA sa od seba vzdialia do strán, na každé vlákno sedí špeciálny enzým, ktorý syntetizuje nový reťazec. Syntéza prebieha podľa princípu komplementarity, to znamená, že ak je nukleotid A v pôvodnom reťazci DNA, potom T bude v novosyntetizovanom reťazci, ak G - potom C atď. Tento špeciálny „stavebný“ enzým potrebuje „semienko“ – sekvenciu 5-15 nukleotidov – na spustenie syntézy. Toto „semeno“ je definované pre každý gén (gén chlamýdií, mykoplazma, vírusy) experimentálne.

Takže každý cyklus PCR pozostáva z troch etáp. V prvej fáze nastáva takzvané odvíjanie DNA – teda oddelenie dvoch reťazcov DNA spojených navzájom. V druhom je „semeno“ pripojené k časti vlákna DNA. A nakoniec, predlžovanie týchto reťazcov DNA, ktoré je produkované enzýmom "staviteľ". V súčasnosti celý tento zložitý proces prebieha v jednej skúmavke a pozostáva z opakovaných cyklov reprodukcie stanovenej DNA s cieľom získať veľké množstvo kópií, ktoré je možné následne odhaliť bežnými metódami. To znamená, že z jedného vlákna DNA získame stovky alebo tisíce.

Etapy štúdie PCR

Zber biologického materiálu na výskum

Ako vzorka slúži rôzny biologický materiál: krv a jej zložky, moč, sliny, sekréty slizníc, likvor, výtok z povrchov rán, obsah telových dutín. Všetky biologické vzorky sa odoberajú pomocou jednorazových nástrojov a odobratý materiál sa umiestni do sterilných plastových skúmaviek alebo sa umiestni na kultivačné médium, po čom nasleduje preprava do laboratória.

K odobratým vzorkám sa pridajú potrebné reagencie a umiestnia sa do programovateľného termostatu – termocykléra (zosilňovača). V cykléri sa cyklus PCR opakuje 30-50 krát, pozostáva z troch fáz (denaturácia, žíhanie a predlžovanie). Čo to znamená? Uvažujme podrobnejšie.

Etapy okamžitej PCR reakcie, kopírovanie genetického materiálu

jaFáza PCR - Príprava genetického materiálu na kopírovanie.
Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, zatiaľ čo vlákna DNA sú odpojené a môžu na nich sedieť „semená“.

„Semená“ priemyselne vyrábajú rôzne výskumné a výrobné združenia, laboratóriá kupujú hotové. Zároveň „semeno“ na detekciu napríklad chlamýdií funguje iba na chlamýdie atď. Ak sa teda biomateriál testuje na prítomnosť chlamýdiovej infekcie, potom sa do reakčnej zmesi vloží „semeno“ na chlamýdie; ak testujeme biomateriál na vírus Epstein-Barrovej, potom „semeno“ na vírus Epstein-Barrovej.

IIštádium – Spojenie genetického materiálu pôvodcu infekcie a „semena“.
Ak existuje DNA vírusu alebo baktérie, ktorá sa má určiť, "semeno" sedí na tejto DNA. Tento proces pridávania primérov je druhým krokom PCR. Táto fáza prebieha pri teplote 75°C.

IIIštádium - Kopírovanie genetického materiálu pôvodcu infekcie.
Ide o proces skutočného predlžovania alebo rozmnožovania genetického materiálu, ku ktorému dochádza pri 72°C. K "semenám" sa priblíži tvorca enzýmov a syntetizuje nové vlákno DNA. S ukončením syntézy nového reťazca DNA končí aj cyklus PCR. To znamená, že v jednom cykle PCR sa množstvo genetického materiálu zdvojnásobí. Napríklad v počiatočnej vzorke bolo 100 molekúl DNA vírusu, po prvom cykle PCR už bude vo vzorke 200 molekúl DNA testovaného vírusu. Jeden cyklus trvá 2-3 minúty.

Aby sa vytvoril dostatok genetického materiálu na identifikáciu, zvyčajne sa vykoná 30-50 cyklov PCR, čo trvá 2-3 hodiny.

Štádium identifikácie rozmnožovaného genetického materiálu

Tu sa samotná PCR končí a potom prichádza rovnako významná fáza identifikácie. Na identifikáciu sa používa elektroforéza alebo označené "semená". Pri použití elektroforézy sa výsledné vlákna DNA oddelia podľa veľkosti a prítomnosť fragmentov DNA rôznych dĺžok indikuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená prítomnosť konkrétneho vírusu, baktérie atď.). Pri použití označených „semien“ sa do konečného produktu reakcie pridáva chromogén (farbivo), v dôsledku čoho je enzymatická reakcia sprevádzaná tvorbou farby. Vývoj farby priamo naznačuje, že v pôvodnej vzorke je prítomný vírus alebo iné detekovateľné činidlo.

Dnes je možné pomocou označených „semien“, ako aj vhodného softvéru okamžite „čítať“ výsledky PCR. Ide o takzvanú real-time PCR.

Prečo je diagnostika PCR taká cenná?

Jednou z významných výhod metódy PCR je jej vysoká citlivosť – od 95 do 100 %. Tieto výhody však musia byť založené na nevyhnutnom dodržaní nasledujúcich podmienok:

1. správny odber vzoriek, preprava biologického materiálu;
2. dostupnosť sterilných nástrojov na jedno použitie, špeciálnych laboratórií a vyškoleného personálu;
3. prísne dodržiavanie metodiky a sterility počas analýzy

Citlivosť sa líši pre rôzne zistené mikróby. Takže napríklad citlivosť metódy PCR na detekciu vírusu hepatitídy C je 97-98%, citlivosť na detekciu ureaplazmy je 99-100%.

Schopnosti, ktoré sú súčasťou analýzy PCR, vám umožňujú dosiahnuť neprekonateľnú analytickú špecifickosť. To znamená presne identifikovať mikroorganizmus, ktorý sa hľadal, a nie podobný alebo blízko príbuzný.
Diagnostická senzitivita a špecifickosť metódy PCR často prevyšuje metódu kultivácie, ktorá sa nazýva „zlatý štandard“ na detekciu infekčných ochorení. Vzhľadom na trvanie kultivačného rastu (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov) je výhoda metódy PCR zrejmá.

PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódy PCR (senzitivita a špecifickosť) predurčujú široké možnosti využitia v modernej medicíne.
Hlavné oblasti použitia diagnostiky PCR:

1. diagnostika akútnych a chronických infekčných ochorení rôznej lokalizácie
2. sledovanie účinnosti terapie
3. objasnenie typu patogénu

PCR sa používa v pôrodníctve, gynekológii, neonatológii, pediatrii, urológii, venerológii, nefrológii, klinike infekčných chorôb, oftalmológii, neurológii, ftizeiopulmonológii atď.

Použitie diagnostiky PCR sa uskutočňuje v spojení s inými výskumnými metódami (ELISA, PIF, RIF atď.). Ich kombináciu a účelnosť určuje ošetrujúci lekár.

Infekčné agens detekované pomocou PCR

Vírusy:

1. Retrovírusy HIV-1 a HIV-2
2. herpetiformné vírusy
3. vírus herpes simplex typu 1 a 2

Realizácia PCR analýzy (PCR diagnostika) začína odberom materiálu na vyšetrenie gynekológom, urológom alebo dermatovenerológom. Kvalita a spoľahlivosť následne získaných výsledkov je zabezpečená najvyššou kvalifikáciou a rozsiahlymi skúsenosťami lekárov medicínskeho centra Euromedprestige, ktorí dodržiavajú všetky potrebné pravidlá na vykonávanie PCR analýzy: úplná sterilita, používanie výhradne jednorazových materiálov.

Zozbieraný materiál z kefy sa umiestni do nádoby s fyziologickým roztokom. Po odbere vzoriek by sa vzorky mali čo najskôr doručiť do laboratória PCR.

PCR analýza v laboratóriu prebieha v troch fázach:

1. izolácia DNA
2. Amplifikácia fragmentov DNA
3. Detekcia produktov amplifikácie DNA

Extrakcia DNA je počiatočným štádiom diagnostiky PCR, ktorej podstata je nasledovná: lekár odoberie materiál na výskum od pacienta a podrobí ho špeciálnemu spracovaniu. Počas spracovania sa dvojitá špirála DNA rozdelí na samostatné vlákna. Do materiálu pacienta sa pridáva špeciálna kvapalina, ktorá sa rozpúšťa organickej hmoty zasahovanie do "čistoty" reakcie. Tým sa odstránia lipidy, aminokyseliny, peptidy, sacharidy, proteíny a polysacharidy. Výsledkom je DNA alebo RNA.

Princípom metódy PCR je „vybudovanie“ nových infekcií DNA alebo RNA. To sa nedá urobiť bez odstránenia bunkového materiálu.

Množstvo času stráveného extrakciou DNA závisí od pôvodcu infekcie a od typu materiálu použitého na testovanie PCR. Napríklad príprava krvi na ďalší krok trvá 1,5-2 hodiny.

0Pole ( => Analýzy) Pole ( => 2) Pole ( =>.html) 2

amplifikácia DNA

Na realizáciu ďalšej etapy DNA diagnostiky – amplifikácie DNA – používajú lekári takzvané DNA matrice – molekuly DNA infekcií, na ktorých následne dôjde k „klonovaniu“ DNA. Už bolo spomenuté, že nie je potrebná prítomnosť kompletnej DNA infekcie, pre toto štádium stačí malý kúsok molekuly DNA, ktorá je pre tento mikrób jedinečná (infekcia).

V srdci amplifikácie DNA, a teda aj v srdci celého princípu reakcie PCR, je prirodzený proces kompletizácie DNA pre všetky živé veci - replikácia DNA, ktorá sa uskutočňuje zdvojením jedného reťazca DNA.

Počnúc jedným fragmentom DNA, laboratórny lekár ho skopíruje a zvyšuje počet kópií v reťazovej reakcii: po prvom cykle máte už 2 fragmenty, po druhom cykle - 4, po treťom - 8, po štvrtom - 16, potom 32, 64, 128, 256... S každým cyklom sa počet kópií zdvojnásobuje a po dvadsiatich cykloch ide počet na milióny a po tridsiatich na miliardy. Cyklus trvá niekoľko minút a redukuje sa na určitú zmenu teplotného režimu vo veľmi malom chemickom reaktore. Tu sú v roztoku v dostatočnom množstve všetky potrebné zložky syntézy, predovšetkým nukleotidy A, G, T a C, a tiež sa vykonali jemné prípravné chemické operácie, aby sa okamžite vytvorila presná kópia každý hotový segment DNA, potom z tejto kópie - opäť kópia, toto je rozvetvená reťazová reakcia.

Naviazaním primerov na reťazec DNA - umelo syntetizované "kúsky" DNA (nukleotidové páry) podobné DNA mikróbov (infekcia) - dva krátke, pozostávajúce z dvoch reťazcov úsekov DNA, vznikajú helixy, ktoré sú nevyhnutné pre syntézu budúcej DNA.

Syntéza nového reťazca nastáva dokončením každého z dvoch reťazcov DNA. K procesu amplifikácie dochádza pomocou špecifického miesta - DNA polymerázy, ktorá dala názov laboratórnej metóde. Polymeráza pôsobí ako katalyzátor reakcie a monitoruje sekvenčné pripojenie nukleotidových báz k rastúcemu novému vláknu DNA.

Amplifikácia DNA je teda viacnásobné zvýšenie počtu kópií DNA, ktoré sú špecifické, t. j. vlastné len určitému organizmu. Nie je potrebné dokončiť celý reťazec DNA, aby ste videli pôvodcu infekcie. Potrebná je len oblasť, ktorá je charakteristická pre túto baktériu ako jednotlivca.

5360 rubľov. Náklady na komplexný program s gastroenterológom

25% ZĽAVA NA PRÍJME KU KARDIOLOGOVI

- 25%primárny
Návšteva lekára
víkendový terapeut

5 160 rubľov. namiesto 5 420 rubľov. Vyšetrenie mužov na urologické infekcie

ALERGOLÓGIA 5 120 rubľov. namiesto 5 590 rubľov.

Všetky početne sa opakujúce kroky amplifikácie prebiehajú pri rôznych teplotách. Na PCR analýzu sa používa špeciálne programovateľné zariadenie - PCR - termostat alebo zosilňovač, ktorý automaticky mení teploty. Amplifikácia sa uskutočňuje podľa vopred určeného programu zodpovedajúceho typu detekovanej infekcie. V závislosti od programu a typu detekovanej infekcie trvá proces automatizovanej PCR 2 až 3 hodiny.

Dôležitú úlohu v diagnostike PCR zohráva kvalifikácia laboratórneho asistenta vykonávajúceho analýzu, od toho závisí správne nastavenie PCR zariadenia a interpretácia výsledkov. Lekári Euromedprestige Medical Center majú bohaté skúsenosti s vykonávaním DNA diagnostiky, čo zaisťuje spoľahlivosť výsledkov štúdie a zaručuje pozitívny úspech pri liečbe infekčných ochorení. Absolvovať testy PCR a vykonať kompletnú diagnostiku a liečbu infekčných chorôb v našom lekárskom centre "Euromedprestige".

Počas detekcie produktov amplifikácie sa výsledná zmes produktov amplifikácie oddelí. Do zmesi sa pridávajú špeciálne roztoky, ktoré dodávajú fragmentom DNA schopnosť fluorescencie - odrážať oranžovo-červené svietiace pásiky. Výsledná žiara indikuje prítomnosť DNA vírusov, mikróbov alebo baktérií v materiáli odobratom pacientovi na analýzu PCR.

PCR (polymerázová reťazová reakcia) je výdobytok molekulárnej biológie, jedna z hlavných metód klinickej laboratórnej diagnostiky konca 20. a začiatku 21. storočia, prinášajúca veľké výhody v rôznych oblastiach lekárskej vedy.

Aj keď sa teda medzi miliónmi buniek ľudského tela nestratí samotný živý vírus, ale iba častica jeho DNA, potom si PCR, ak do nej nič nezasahuje, pravdepodobne poradí a ohlási pobyt „cudzieho“ s pozitívnym výsledkom. Toto je podstata PCR a jej hlavná výhoda.

Výhody a nevýhody

Na laboratórium vykonávajúce PCR diagnostiku sú kladené najvyššie požiadavky z hľadiska vybavenia, testovacích systémov a kvalifikácie zdravotníckeho personálu. Ide o high-tech laboratórium, ktoré má arzenál vysoko citlivých a vysoko špecifických činidiel, takže nemá žiadne zvláštne nevýhody. Pokiaľ neprinesie pozitívny výsledok pri absencii klinických prejavov, a teda nepostaví lekára pred dilemu: oplatí sa začať s liečbou alebo nie?

Lekár, ktorý pozoruje pacienta, začína pochybovať o spoľahlivosti výsledkov testov, pretože nevidí žiadne príznaky choroby. Ale napriek tomu, vzhľadom na vysokú citlivosť systému PCR, treba pamätať na to, že deteguje patogén aj v predklinickom štádiu a pozitívny výsledok je v tomto prípade skôr výhodou ako nevýhodou. Na základe toho musí ošetrujúci lekár sám rozhodnúť o vhodnosti terapie s prihliadnutím na ďalšie argumenty pre a proti.

Výhody diagnostiky pomocou polymerázovej reťazovej reakcie sú zrejmé:

• Vysoká špecifickosť dosahujúc 100 %, v dôsledku prítomnosti vo vybranej vzorke častíc nukleovej kyseliny, ktoré sú vlastné konkrétnemu organizmu, ale sú pre človeka cudzie;
• Vysoký výkon PCR je predsa high-tech automatizovaná technika, ktorá poskytuje možnosť vykonať testovanie v deň odberu materiálu a zbaviť tak pacienta zbytočných starostí;
• PCR, pracujúca na jednej vzorke, je schopná vykonať niekoľko štúdií a približne odhaliť viacero patogénov ak má takúto úlohu. Napríklad pri diagnostike chlamýdiovej infekcie, kde je PCR jednou z hlavných metód, sa dá spolu s chlamýdiami zistiť aj Neisseria (gonokok) – patogén. Navyše to nemá negatívny vplyv na spoľahlivosť výsledkov;
• PCR testovanie je nebezpečný mikroorganizmus inkubačná doba keď ešte nemali čas spôsobiť telu hmatateľnú ujmu, tj. skorá diagnóza varuje pred nadchádzajúcim vývojom patologického procesu, ktorý umožňuje pripraviť sa naň a vziať ho plne vyzbrojený.

Okrem toho, aby sa predišlo nedorozumeniam, ktoré pri diagnostike niekedy vznikajú, PCR sa chráni aj tým, že jej výsledky je možné zaznamenať (fotografovať, počítač) a v prípade potreby ich použiť na expertné účely.

Norma v odpovediach PCR sa považuje za negatívny výsledok. indikujúce neprítomnosť fragmentov cudzích nukleových kyselín, pozitívna odpoveď bude indikovať prítomnosť infekcie v tele, digitálne hodnoty ​​indikujú stav vírusu a jeho koncentráciu v čase testovania. Kompletný prepis analýzy však vykonáva lekár, ktorý absolvoval špeciálne školenie na tému „PCR“. Pokúšať sa interpretovať výsledky sami nemá zmysel, pretože je možné, čo sa pravdepodobne stane, nepochopiť a začať sa obávať vopred.

Čoho sa PCR „bojí“, čo dokáže a ako sa na to pripraviť?

Ako pri každej inej štúdii, niekedy sú výsledky testov falošne pozitívne alebo falošne negatívne kde PCR nie je výnimkou. To sa môže stať v nasledujúcich prípadoch:

1. Porušenie technologického procesu v jednej z fáz reakcie;
2. Nedodržiavanie pravidiel pre zber materiálu, jeho skladovanie alebo prepravu;
3. Prítomnosť cudzích nečistôt v materiáli.

To naznačuje, že k PCR - diagnostike infekcií je potrebné pristupovať opatrne, starostlivo a presne, inak môžu vzorky materiálu zmeniť svoju štrukturálnu štruktúru alebo dokonca skolabovať.

Etapy diagnostiky PCR. Falošné výsledky môžu spôsobiť porušenie v ktorejkoľvek fáze štúdie

PCR diagnostika infekcií patrí medzi ostatné laboratórne metódy do kategórie „zlatých štandardov“, preto sa ňou dajú vyhľadávať patogény mnohých chorôb, ktoré na prvý pohľad nemajú nič spoločné:

• Tuberkulóza rôznej lokalizácie, zápal pľúc (vrátane atypických, spôsobených chlamýdiami);
• Detské infekcie (osýpky, rubeola, parotitída, osýpky);
• záškrtu;
• salmonelóza;
• Zoonotické infekčné ochorenie - listerióza (ochorenie je charakterizované rôznymi príznakmi s poškodením lymfatických uzlín, centrálneho nervového systému, vnútorných orgánov);
• Choroby spôsobené penetráciou vírusu Epstein-Barrovej ( Infekčná mononukleóza atď.);
• Onkologická patológia vyvolaná infekciou papilomavírusom (HPV a jeho typy);
• Borelióza (lymská borelióza, kliešťová encefalitída);
• Infekcia Helicobacter pylori, ktorej pôvodcom je baktéria Helicobacter pylori žijúca v ľudskom žalúdku. Je dokázané, že Helicobacter spôsobuje rozvoj rakoviny žalúdka alebo dvanástnika;
• a prakticky všetko.

PCR diagnostika pohlavne prenosných infekcií je mimoriadne dôležitá, pretože takto spôsobené ochorenia často prebiehajú dlho bez klinických prejavov, no v tehotenstve sa začínajú aktivizovať a ohrozujú tak zdravie a dokonca aj život dieťaťa. . A správajte sa podobne. Niektoré z nich ("pochodeň") sú súčasne spojené s pohlavne prenosnými chorobami, takže si vyžadujú podrobnejšie posúdenie. Čitateľ sa bude môcť zoznámiť s najobľúbenejšími metódami v nasledujúcich častiach článku.

Ako sa správne pripraviť, aby ste dosiahli spoľahlivý výsledok?

Hneď si všimneme, že príprava na PCR je pomerne jednoduchá, nie osobitné úsilie na strane pacienta sa nevyžaduje. Stačí splniť tri jednoduché úlohy:

1. Nemajte pohlavný styk 24 hodín pred vykonaním testu;
2. Ak chcete odobrať a analyzovať krv z žily, musíte prísť na prázdny žalúdok, mimochodom, nemôžete ani piť;
3. Moč by sa mal podávať v noci (ráno - v sterilnej nádobe zakúpenej deň predtým v lekárni).

PCR môže fungovať v akomkoľvek biologickom prostredí

Metóda PCR nie je „krvavá“, preto akceptuje akékoľvek biologické prostredie obsahujúce podozrivý infekčný agens.Spravidla výber - to, čo musíte vziať na výskum, zostáva u lekára.

Preto pri hľadaní patogénu môžete okrem krvného testu (hoci je tiež vhodný a vo väčšine prípadov súbežne s iným materiálom) použiť:

• (výtok z urogenitálneho traktu);
• Škrabanie slizníc ústnej dutiny, spojovky, nosohltanu, pohlavného traktu (u žien sa odoberajú z krčka maternice a vagíny, u mužov - z močovej trubice);
• sliny;
• sperma;
• šťava z prostaty;
• Tkanivá placenty a plodová voda (plodová voda);
• Močový sediment (po odstredení), napríklad na detekciu určitých STI a Mycobacterium tuberculosis;
• Spútum a pleurálna tekutina na rovnaký účel;
• exsudáty;
• Cerebrospinálna tekutina v prípade podozrenia na infekčnú léziu centrálneho nervového systému;
• Bioptický materiál (biopsia) odobratý z pečene, dvanástnika, žalúdka atď.

K vyššie uvedenému by som chcel dodať, že vo všetkých prípadoch, dokonca aj v zoškraboch a sekrétoch, bude dostatok materiálu na testovanie, keďže testovanie PCR nevyžaduje veľké objemy, na analýzu stačí niekoľko mikrolitrov, ktoré sa zvyčajne berú do Mikroskúmavka typu Eppendorf a odoslaná na štúdium.

Choroby a použitie PCR

HIV a polymerázová reťazová reakcia

Zvyčajne sa pri absolvovaní anonymného vyšetrenia v prípade pozitívnych výsledkov imunoblottingu diagnóza znova opakuje. Ak sa diagnóza potvrdí, pacientovi sa predpíšu ďalšie štúdie:

1. Stanovenie absolútnych hodnôt počtu CD 4 lymfocytov (imunokompetentných buniek - T-pomocníkov alebo pomocníkov), ktoré infekcia infikuje ako prvé, potom strácajú svoje základné vlastnosti a nedokážu rozlišovať medzi „ vlastné“ a niekoho iného. Berú RNA vírusu cirkulujúceho v krvnej plazme pre normálne bunky tela a nereagujú na ne;
2. Detekcia vírusovej RNA pomocou PCR a výpočet koncentrácie vírusových častíc, aby sa na základe týchto údajov stanovilo štádium, závažnosť patologického procesu a prognóza. Slovo „norma“ v tomto ohľade samozrejme neexistuje, pretože reakcia je vždy pozitívna a dekódovanie digitálnych hodnôt je v kompetencii lekára.

PCR a hepatitída

Metóda PCR dokáže odhaliť patogény, najčastejšie sa test používa na diagnostiku hepatitídy C, ktorá je inými metódami slabo detekovaná.

Vírus hepatitídy C (obsahujúci RNA) svojím správaním v ľudskom tele pripomína HIV. Vklínený do genómu pečeňových buniek (hepatocytov) tam ostane čakať v krídlach, čo môže prísť minimálne o 2 roky neskôr, minimálne o 20 rokov neskôr, takže ho lekári nazývali „jemný zabijak“. Hepatitída C vedie k vzniku malígneho procesu v pečeňovom parenchýme, ktorý sa prejavuje v neskorších štádiách. Imunitný systém si nevšimne všetky tieto udalosti a pomýli si vírus s hepatocytom. Je pravda, že protilátky proti vírusu sa vytvárajú v určitom množstve, ale neposkytujú slušnú imunitnú odpoveď. Na diagnostiku hepatitídy C nie je ELISA veľmi informatívna, pretože naznačuje, že vírus zanechal stopy a nie je známe, či odišiel sám. Pri HCV sú známe prípady samohojenia, zatiaľ čo protilátky proti vírusu zostávajú a naďalej kolujú po celý život (imunologická pamäť). PCR výrazne predbieha tvorbu protilátok a dokáže detekovať vírusovú časticu už za 1-1,5 týždňa, zatiaľ čo protilátky sa môžu objaviť v rozmedzí od 2 mesiacov do šiestich mesiacov

PCR diagnostika v prípade podozrenia na nekontrolovateľný vírus hepatitídy C v ľudskom tele je najoptimálnejšou výskumnou metódou, pretože len ona je schopná rozpoznať prítomnosť „nežného nepriateľa“ v pacientovej krvi alebo biopsii pečene.

Niekedy však existujú prípady, keď sú AT pozitívne a výsledok PCR je negatívny. To sa niekedy stáva, keď je množstvo vírusu veľmi nízke alebo keď je v nečinnosti v pečeni bez toho, aby sa dostal do krvného obehu. Aby sa stále našla pravda, pacient je znovu analyzovaný, alebo dokonca viac ako jeden.

Infekcia papilomavírusom

Ak nedôjde k samoliečeniu, môže tiež bez toho, aby sa prejavil, dlho pretrvávať v tele hostiteľa, ktorý o tom ani netuší, keďže PCR sa nerobila a choroba nemala žiadne príznaky. Avšak prítomnosť papilómu vírusová infekcia, aj keď latentný, nie je ani zďaleka ľahostajný k ľudskému zdraviu, kde niektoré typy vírusov spôsobujú onkologické ochorenia(typy 16, 18).

Častejšie trpí HPV ženská polovica populácie, keďže vírus viac miluje oblasť ženských pohlavných orgánov a najmä krčka maternice, kde niektoré typy vírusov prispievajú k rozvoju dysplastických procesov, a potom rakovinu krčka maternice, ak nie je dysplázia. ošetrené a vírus sa uvoľní. Polymerázová reťazová reakcia teda deteguje vírusovú DNA a potom označí „zlý“ alebo „dobrý“ (onkogénny alebo neonkogénny) typ usadený v tele ženy.

Iné STI a infekcie TORCH

Je zrejmé, že polymerázová reťazová reakcia môže nájsť akúkoľvek cudziu štruktúru pozostávajúcu z nukleových kyselín, takže tento test je vhodný na detekciu všetkých pohlavne prenosných chorôb a infekcií TORCH, avšak nie vždy sa používa. Prečo, povedzme, robiť taký drahý výskum na detekciu gonokoka, ak existujú dostupnejšie a lacnejšie?

Infekcie TORCH a STI sú tak vzájomne prepojené, že je niekedy ťažké určiť, do ktorej skupiny by mal byť konkrétny patogén priradený. Vo všeobecnosti môže byť ťažké im porozumieť, pretože ide o pomerne rôznorodé skupiny mikroorganizmov, ktoré môžu byť sexuálne prenosné vždy alebo len za určitých podmienok (imunodeficiencia) a môžu byť zaujímavé len počas tehotenstva z dôvodu možného negatívneho vplyvu na jej priebehu a na plod.

PCR je hlavnou metódou na detekciu latentných infekcií

Vývoj klinických prejavov je založený na rôznych patogénoch, ktoré možno nájsť iba pomocou PCR, čo je jej hlavnou úlohou, niekedy spolu s ELISA, a niekedy ako jediný potvrdzujúci test, najmä ak nie sú žiadne príznaky ochorenia. Takúto zložitú situáciu môže vyvolať polymikrobiálna infekcia, ktorá okrem zjavných patogénov zahŕňa aj oportúnne patogény.

Ureaplazma sa často pozoruje v tandeme s mykoplazmou. A to nie je náhoda. Tieto druhy, podobne ako chlamýdie, nie sú ani vírusmi, ani baktériami, žijú vo vnútri buniek a patria k pohlavne prenosným chorobám, hoci ich prítomnosť v zdravom tele nie je ani zďaleka nezvyčajná. Aby sa teda rozlíšil zdravý nosič od chorého človeka, sú potrebné špeciálne metódy, kde sa PCR považuje za najspoľahlivejšie, pretože vzhľadom na zvláštnosti štruktúry a správania týchto mikroorganizmov sú iné štúdie neúčinné.

Pokiaľ ide o (typ 1, 2) a ktorý tiež patrí medzi herpetické vírusy (typ 5), situácia tu je tiež nejednoznačná. Infekcia svetovej populácie sa blíži k 100 %, preto je v tomto prípade veľmi dôležitá identifikácia vírusu a jeho dávka, čo je obzvlášť dôležité počas tehotenstva, pretože u dospelého človeka je vírus, ktorý sa zakorenil v jeho telo často nespôsobuje žiadne problémy a nevykazuje príznaky choroby.

Preto by sa takéto vyšetrenie predpísané lekárom nemalo ignorovať, pretože v niektorých prípadoch je polymerázová reťazová reakcia povinnou a nevyhnutnou metódou laboratórnej diagnostiky, ktorá dokáže ochrániť nielen ženu, ale aj malého, ešte nenarodeného muža pred vážnymi komplikáciami.

Na záver by som rád poznamenal, že taká úžasná metóda ako PCR slúži ľudstvu už viac ako 30 rokov. Zároveň sa úlohy testu neobmedzujú len na vyhľadávanie patogénov infekčných chorôb. Polymerázová reťazová reakcia, ktorá sa zrodila na pôde molekulárnej biológie, je neoddeliteľne spojená s genetikou úspešne používané vo forenznej oblasti na identifikáciu osôb, v súdnom lekárstve na určenie otcovstva, vo veterinárnej medicíne, ak má zvieracia klinika možnosť nákupu drahého vybavenia, ako aj v iných oblastiach (priemysel, poľnohospodárstvo a pod.).

Video: PCR - podstata a aplikácia

PCR analýza je moderná a vysoko presná diagnostická metóda, ktorá umožňuje identifikovať pôvodcu infekcie bez ohľadu na štádium patológie. Dnes je táto metóda vyšetrenia považovaná za najspoľahlivejšiu, pretože vylučuje príjem falošných údajov kvôli vysokej úrovni špecifickosti.

Podstata metódy PCR

PCR analýza - polymerázová reťazová reakcia, ktorá umožňuje opakovane zvyšovať objem mikrobiálneho prostredia a určiť patogén. Fenomén PCR objavil v 20. storočí americký vedec Kary Mullis, vďaka čomu sa výrazne skrátil čas na stanovenie presnej diagnózy a následne lekári začali rýchlejšie predpisovať adekvátne terapeutické opatrenia.

Podstatou analýzy PCR je namnoženie fragmentov DNA patogénu získaných z biologických vzoriek pacienta (moč, krv, sliny a iné). Táto technika umožňuje pomocou špeciálnych enzýmov zväčšiť určité úseky genetického materiálu v umelom prostredí, navyše počet študovaných fragmentov narastie do takej miery, že ich možno vizuálne preskúmať.

Je potrebné poznamenať, že počas analýzy PCR sa skopírujú iba určité oblasti, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v diagnostike. Ak sú v tele pacienta prítomné v zanedbateľnom množstve, táto analýza ich dokáže identifikovať.

Technika PCR sa aktívne používa v lekárskej praxi na štúdium infekčných a dedičné choroby, pretože okrem jednoduchého zvýšenia množstva genetického materiálu (amplifikácie) vám umožňuje spájať jednotlivé fragmenty DNA a zavádzať mutácie, čím sa vykonáva kontrola nad génmi, ktoré vyvolávajú obavy.

Čo odhalí analýza PCR?

PCR analýza je široko používaná v rôznych oblastiach medicíny. Samozrejme, najčastejšie sa používa v gynekológii a urológii, no technika je aktuálna aj pre pneumológiu, ftizeológiu, gastroenterológiu, onkológiu a ďalšie oblasti.

PCR analýza dokáže detekovať vírusy na rôznych štádiách choroby, je tiež schopný odhaliť latentné alebo „spiace“ mikroorganizmy, ktoré nespôsobujú výskyt klinických príznakov:

• Ľudský papilomavírus rôznych typov (HPV);
• chlamýdie;
• Trichomonas;
• Pôvodca kvapavky;
• mykoplazmy;
• Ureaplasma;
• Gardnerella;
• huby Candida;
• Microbacterium tuberculosis;
• vírusy hepatitídy A, B a C;
• helikobaktérie;
• herpes vírusy;
• cytomegalovírusy (CMV);
• Vírusy Epstein-Barr.

Výhody analýzy PCR

1. Vysoká presnosť analýzy: riziko získania falošne negatívnych výsledkov je minimálne;
2. Špecifickosť techniky: PCR analýza umožňuje izolovať špecifické infekčné činidlo, jeho typ a typ;
3. Precitlivenosť: PCR analýza deteguje aj niekoľko fragmentov DNA mikroorganizmu;
4. Možnosť štúdia rôznych biologických prostredí tela;
5. Rýchlosť dosiahnutia výsledkov: možno ich získať 4-5 hodín po zákroku;
6. Možnosť detekcie viacerých mikroorganizmov z jednej vzorky biologického materiálu.

PCR analýzu aktívne využívajú lekári rôznych špecializácií, zatiaľ čo iné diagnostické metódy sú odsunuté do pozadia. Stojí za zmienku, že tento postup umožňuje identifikovať nosiče infekcie a latentné formy ochorenia, pri ktorých neexistujú žiadne klinické prejavy, ale tieto patogény negatívne ovplyvňujú celkový stav tela a jeho funkčnosť a pacienti predstavujú nebezpečenstvo pre iní.

Príprava a realizácia PCR analýzy

Fragmenty DNA mikroorganizmov sa nachádzajú v rôznych biologických prostrediach pacienta. Samotní lekári určujú oblasti na odber materiálov na analýzu PCR, ktoré závisia od typu ochorenia a jeho lokalizácie. Ak ste sa obrátili na venerológa, aby identifikoval sexuálne prenosné infekcie (STI), potom sa vyšetrí výtok z pohlavných orgánov (náter alebo škrabanie z krčka maternice, vagíny) a močovej trubice, ako aj krv a moč.

Herpetické infekcie a mononukleóza sa diagnostikujú na základe rozboru sterov z ústnej dutiny pacienta. CMV sa potvrdí po vyšetrení moču, likvoru. Na pulmonologickom oddelení sa odoberie spútum a obsah pleurálnej dutiny na analýzu PCR. U tehotných žien sa pri podozrení na vnútromaternicové infekcie plodu vyšetruje plodová voda a tkanivá placenty.

Aby sa vylúčila možnosť chybných výsledkov a zvýšila presnosť analýzy PCR, pred odoslaním biologického materiálu by sa mali dodržiavať jednoduché odporúčania:

• Väčšina mikróbov sa vyplaví močom, preto by ste pred odberom náteru z močovej trubice nemali močiť;
• Do 3-5 dní by ste sa mali zdržať pohlavného styku;
• PCR analýza sa nevykonáva ihneď po ukončení menštruačného toku, mali by ste počkať 5-7 dní;
• 4 hodiny pred darovaním slín je potrebné prestať užívať lieky a jedlo a pred procedúrou sa odporúča vypláchnuť ústa vodou a vykonať ľahkú masáž v oblasti líc;
• Moč sa má odoberať ráno do sterilnej nádobky, aby sa predišlo kontaminácii materiálu, pred odberom by sa mal umyť, ženám vložiť sterilný tampón do vagíny a mužom čo najviac oddialiť záhyb predkožky ako sa dá;
• Deň pred dodaním materiálu sa musíte zdržať pitia alkoholu, korenistých jedál a horúcich procedúr (sauny, kúpele atď.);
• 2 týždne pred analýzou PCR je potrebné prestať užívať antibakteriálne látky;
• Týždeň pred vyšetrením je pozastavené používanie intímnych gélov, mastí a vaginálnych čapíkov.

Ide o pomerne jednoduché pravidlá, ktoré vám však pomôžu dosiahnuť najspoľahlivejšie výsledky a znížia riziko chýb v diagnostike.

Dešifrovanie analýzy PCR

Výsledky testu PCR môžu byť pozitívne alebo negatívne. Negatívny výsledok testu naznačuje neprítomnosť infekcie v biologických materiáloch.

Pozitívny výsledok potvrdzuje prítomnosť mikroorganizmov, ale pre presnú diagnózu je potrebná informácia o ich počte. V našom tele sú skutočne oportúnne mikróby, ktoré sa stávajú príčinami chorôb iba v dôsledku aktívneho rastu a reprodukcie. Na základe kvantitatívnych údajov analýzy PCR môže lekár zistiť štádium vývoja patologického procesu, jeho aktivitu, vybrať konkrétny liek a jeho dávkovanie.

PCR analýza počas tehotenstva

Tehotenstvo je špeciálne obdobie v živote každej ženy. V tomto období môžu byť mnohé STI alebo latentné infekcie pre dieťa mimoriadne nebezpečné a spôsobiť predčasný pôrod, potrat, malformácie a vývojové anomálie. Preto sa PCR analýza vykonáva u všetkých tehotných žien plánovaným spôsobom, najmä v počiatočných štádiách (do 12 týždňov), ale niekedy sa predpisuje aj počas 2. trimestra.

Materiál sa odoberá z cervikálneho kanála a močovej trubice, zákrok je bezbolestný a nepredstavuje hrozbu. Vo väčšine prípadov sa analýza PCR vykonáva na chlamýdie, ureaplazmy, mykoplazmy, cytomegalovírus, herpes a HPV. Práve tieto mikroorganizmy predstavujú počas tehotenstva hrozbu. Niekedy však ženy podstupujú komplexnú analýzu PCR, ktorá zahŕňa štúdiu veľkého počtu mikroorganizmov (12 alebo viac).