PCR szakaszok. Polimeráz láncreakció (PCR) - nagy pontosságú módszer specifikus fertőző ágensek kimutatására

A megfelelő és hatékony kezelés sok fertőző betegség időben történő felismerést igényel pontos diagnózis. Ennek a problémának a megoldásában manapság a molekuláris biológiai módszereken alapuló high-tech diagnosztikai módszerek vesznek részt. Jelenleg a polimeráz láncreakciót (PCR) már széles körben alkalmazzák a gyakorlati gyógyászatban, mint a legmegbízhatóbb laboratóriumi diagnosztikai eszközt.

Mi magyarázza a PCR jelenlegi népszerűségét?

Először, ez a módszer különböző fertőző betegségek kórokozóinak nagy pontosságú azonosítására szolgál.

Másodszor, a kezelés hatékonyságának ellenőrzése.

A különböző kézikönyvekben, tájékoztatókban, cikkekben, valamint a szakorvosok magyarázataiban gyakran találkozunk érthetetlen kifejezések, szavak használatával. Valóban nehéz hétköznapi szavakkal beszélni a tudomány csúcstechnológiás termékeiről.

Mi a PCR diagnosztika lényege és mechanikája?

Minden élő szervezetnek megvannak a maga egyedi génjei. A gének a DNS-molekulában helyezkednek el, amely valójában minden egyes organizmus "hívókártyája". A DNS (genetikai anyag) egy nagyon hosszú molekula, amely nukleotidoknak nevezett építőelemekből áll. A fertőző betegségek minden kórokozója esetében szigorúan specifikusak, azaz egy bizonyos sorrendben és kombinációban. Amikor meg kell érteni, hogy egy személynek van-e egy adott kórokozója, biológiai anyagot (vér, vizelet, nyál, kenet) vesznek, amely a mikroba DNS-ét vagy DNS-fragmenseit tartalmazza. De a kórokozó genetikai anyagának mennyisége nagyon kicsi, és nem lehet megmondani, hogy melyik mikroorganizmushoz tartozik. A probléma megoldására a PCR szolgál. A polimeráz láncreakció lényege, hogy kis mennyiségű DNS-t tartalmazó kutatási anyagot vesznek fel, és a PCR folyamat során megnő az adott kórokozóhoz tartozó genetikai anyag mennyisége, és ezáltal azonosítható.

A PCR-diagnosztika egy bioanyag genetikai vizsgálata.

A PCR-módszer ötlete K. Mullins amerikai tudósé, akit 1983-ban javasolt. Széles körű klinikai alkalmazást azonban csak a XX. század 90-es évek közepén kapott.

Foglalkozzunk a terminológiával, mi az - DNS stb. Bármely élőlény (állat, növény, ember, baktérium, vírus) minden sejtje rendelkezik kromoszómákkal. A kromoszómák a genetikai információ őrzői, amelyek az egyes élőlények teljes génszekvenciáját tartalmazzák.

Mindegyik kromoszóma két DNS-szálból áll, amelyek egymáshoz képest hélixbe csavarodnak. A DNS kémiailag dezoxiribonukleinsav, amely a következőkből áll szerkezeti elemek- nukleotidok. A nukleotidoknak 5 típusa van - timin (T), adenozin (A), guanin (G), citozin (C) és uracil (U). A nukleotidok egymás után, szigorú egyedi szekvenciába rendeződnek, géneket képezve. Egy gén 20-200 ilyen nukleotidból állhat. Például az inzulintermelést kódoló gén 60 bázispár hosszú.

A nukleotidoknak komplementaritásuk van. Ez azt jelenti, hogy a DNS egyik szálában a szemközti adeninnel (A) mindig van a másik szálban timin (T), a másik szálban pedig a guaninnal (G) ellentétes citozin (C). Sematikusan így néz ki:
G-C
T-A
NÁL NÉL
A komplementaritás ezen tulajdonsága kulcsfontosságú a PCR-ben.

A DNS mellett az RNS-nek ugyanaz a szerkezete - ribonukleinsav, amely abban különbözik a DNS-től, hogy timin helyett uracilt használ. RNS - a genetikai információ őrzője egyes vírusokban, amelyeket retrovírusoknak neveznek (például HIV).

A DNS és RNS molekulák „szaporodhatnak” ( adott ingatlan PCR-hez használják). Ez a következőképpen történik: két DNS- vagy RNS-szál távolodik el egymástól oldalra, mindegyik szálon egy speciális enzim ül, amely új láncot szintetizál. A szintézis a komplementaritás elve szerint megy végbe, vagyis ha az A nukleotid az eredeti DNS-láncban van, akkor T az újonnan szintetizáltban lesz, ha G - akkor C stb. Ennek a speciális "építő" enzimnek szüksége van egy "magra" - egy 5-15 nukleotidból álló szekvenciára - a szintézis elindításához. Ez a "mag" minden génre (chlamydia gén, mikoplazmák, vírusok) kísérletileg.

Tehát minden PCR ciklus három szakaszból áll. Az első szakaszban a DNS úgynevezett letekercselése következik be, vagyis a két egymáshoz kapcsolódó DNS-szál szétválása. A másodikban a „mag” a DNS-szál egy szakaszához kapcsolódik. És végül ezen DNS-szálak megnyúlása, amelyet az "építő" enzim termel. Jelenleg ez az egész összetett folyamat egy kémcsőben játszódik le, és a meghatározott DNS ismételt reprodukálásából áll, hogy nagyszámú másolatot kapjunk, amelyek aztán hagyományos módszerekkel kimutathatók. Vagyis egy DNS-szálból százakat vagy ezreket kapunk.

A PCR vizsgálat szakaszai

Biológiai anyagok gyűjtése kutatáshoz

Mintaként különféle biológiai anyagok szolgálnak: vér és összetevői, vizelet, nyál, nyálkahártya-váladék, agy-gerincvelői folyadék, sebfelszíni váladék, testüregek tartalma. Minden biomintát eldobható műszerekkel gyűjtenek, az összegyűjtött anyagot steril műanyag csövekbe vagy táptalajra helyezik, majd a laboratóriumba szállítják.

A szükséges reagenseket hozzáadják a vett mintákhoz, és egy programozható termosztátba - egy hőciklusba (erősítőbe) helyezik. A ciklusban a PCR ciklus 30-50-szer megismétlődik, amely három szakaszból áll (denaturáció, lágyítás és elongáció). Mit is jelent ez? Vizsgáljuk meg részletesebben.

Azonnali PCR reakció szakaszai, genetikai anyag másolása

énPCR szakasz - Genetikai anyag előkészítése másoláshoz.
95 ° C-os hőmérsékleten fordul elő, miközben a DNS-szálak megszakadnak, és „magok” ülhetnek rájuk.

A "vetőmagokat" iparilag gyártják a különböző kutató- és termelő egyesületek, a laboratóriumok pedig készeket vásárolnak. Ugyanakkor a „mag” például a chlamydia kimutatására csak a chlamydia esetében működik stb. Így, ha egy bioanyagot chlamydia fertőzés jelenlétére tesztelnek, akkor a reakcióelegybe chlamydia „magot” helyeznek; ha a bioanyagot az Epstein-Barr vírusra tesztelik, akkor az Epstein-Barr vírus "magját".

IIszakasz - A fertőző ágens és a "mag" genetikai anyagának egyesítése.
Ha van meghatározandó vírus vagy baktérium DNS-e, a "mag" ezen a DNS-en ül. Ez a primer hozzáadása a PCR második lépése. Ez a szakasz 75°C hőmérsékleten megy végbe.

IIIszakasz - A fertőző ágens genetikai anyagának másolása.
Ez a genetikai anyag tényleges megnyúlásának vagy szaporodásának folyamata, amely 72°C-on megy végbe. Egy enzimépítő közeledik a "magokhoz", és egy új DNS-szálat szintetizál. Egy új DNS-szál szintézisének végével a PCR ciklus is véget ér. Vagyis egy PCR ciklus alatt a genetikai anyag mennyisége megduplázódik. Például a kezdeti mintában 100 vírus DNS-molekula volt, az első PCR ciklus után már 200 DNS-molekula lesz a vizsgált vírusból a mintában. Egy ciklus 2-3 percig tart.

Az azonosításhoz elegendő genetikai anyag előállítása érdekében általában 30-50 PCR ciklust végeznek, ami 2-3 órát vesz igénybe.

A szaporított genetikai anyag azonosításának szakasza

Maga a PCR itt ér véget, majd jön az azonosítás hasonlóan jelentős szakasza. Az azonosításhoz elektroforézist vagy címkézett "magokat" használnak. Elektroforézis alkalmazásakor a kapott DNS-szálakat méret szerint szétválasztják, és a különböző hosszúságú DNS-fragmensek jelenléte az elemzés pozitív eredményét jelzi (vagyis egy adott vírus, baktérium stb. jelenlétét). Jelzett "magok" alkalmazásakor a reakció végtermékéhez kromogént (festéket) adnak, melynek eredményeként az enzimes reakció színképződéssel jár. A szín kialakulása közvetlenül jelzi, hogy vírus vagy más kimutatható ágens van jelen az eredeti mintában.

Ma már a jelölt "magok", valamint megfelelő szoftverek segítségével azonnal "leolvasható" a PCR eredmények. Ez az úgynevezett valós idejű PCR.

Miért olyan értékes a PCR diagnosztika?

A PCR módszer egyik jelentős előnye a nagy érzékenység - 95-100%. Ezeknek az előnyöknek azonban a következő feltételek elengedhetetlen betartásán kell alapulniuk:

1. helyes mintavétel, biológiai anyag szállítása;
2. steril, eldobható műszerek, speciális laboratóriumok és képzett személyzet rendelkezésre állása;
3. a módszertan szigorú betartása és a sterilitás az elemzés során

Az észlelt mikrobák érzékenysége eltérő. Így például a hepatitis C vírus kimutatására szolgáló PCR-módszer érzékenysége 97-98%, az ureaplasma kimutatásának érzékenysége 99-100%.

A PCR-elemzésben rejlő képességek lehetővé teszik a felülmúlhatatlan analitikai specifitás elérését. Ez azt jelenti, hogy pontosan a keresett mikroorganizmust kell azonosítani, nem pedig egy hasonlót vagy közeli rokont.
A PCR módszer diagnosztikus szenzitivitása és specificitása gyakran meghaladja a tenyésztési módszerét, amelyet a fertőző betegségek kimutatásának "arany standardjának" neveznek. Figyelembe véve a tenyészet növekedésének időtartamát (több naptól több hétig), nyilvánvalóvá válik a PCR módszer előnye.

PCR a fertőzések diagnosztizálásában
A PCR-módszer előnyei (szenzitivitás és specificitás) a modern gyógyászatban az alkalmazások széles körét határozzák meg.
A PCR diagnosztika fő alkalmazási területei:

1. különböző lokalizációjú akut és krónikus fertőző betegségek diagnosztizálása
2. a terápia hatékonyságának nyomon követése
3. a kórokozó típusának tisztázása

A PCR-t a szülészet, nőgyógyászat, neonatológia, gyermekgyógyászat, urológia, venerológia, nefrológia, fertőző betegségek klinikája, szemészet, neurológia, phthisiopulmonology stb.

A PCR diagnosztika alkalmazása más kutatási módszerekkel (ELISA, PIF, RIF stb.) együtt történik. Ezek kombinációját és célszerűségét a kezelőorvos határozza meg.

PCR-rel kimutatott fertőző ágensek

Vírusok:

1. HIV-1 és HIV-2 retrovírusok
2. herpetiform vírusok
3. herpes simplex vírus 1-es és 2-es típusa

A PCR-elemzés (PCR-diagnosztika) lefolytatása a nőgyógyász, urológus vagy dermatovenereológus által végzett vizsgálathoz szükséges anyaggyűjtéssel kezdődik. Az utólag kapott eredmények minőségét és megbízhatóságát az Euromedprestige egészségügyi központ orvosainak legmagasabb képesítése és hatalmas tapasztalata biztosítja, akik betartják a PCR-elemzés elvégzéséhez szükséges összes szabályt: teljes sterilitás, kizárólag eldobható anyagok használata.

Az ecsettel összegyűjtött anyagot sóoldattal ellátott tartályba helyezzük. A mintavétel után a mintákat a lehető leghamarabb a PCR laboratóriumba kell szállítani.

A PCR-elemzés a laboratóriumban három szakaszban zajlik:

1. DNS izolálás
2. DNS-fragmensek amplifikációja
3. DNS-amplifikációs termékek kimutatása

A DNS-kinyerés a PCR-diagnosztika kezdeti szakasza, melynek lényege a következő: az orvos átveszi a pácienstől a kutatásra szánt anyagot és speciális feldolgozásnak veti alá. A feldolgozás során a DNS kettős hélix külön szálakra hasad. A páciens anyagához speciális folyadékot adnak, amely feloldódik szerves anyag zavarja a reakció "tisztaságát". Ez eltávolítja a lipideket, aminosavakat, peptideket, szénhidrátokat, fehérjéket és poliszacharidokat. Az eredmény DNS vagy RNS.

A PCR módszer alapelve az új DNS- vagy RNS-fertőzések „felépítése”. Ezt nem lehet megtenni a sejtes anyag eltávolítása nélkül.

A DNS-kivonásra fordított idő a fertőzés kórokozójától és a PCR-vizsgálathoz használt anyag típusától függ. Például 1,5-2 órát vesz igénybe a vér előkészítése a következő lépéshez.

0Tömb ( => Elemzések) Tömb ( => 2) Tömb ( =>.html) 2

DNS-amplifikáció

A DNS-diagnosztika következő szakaszának - a DNS-amplifikációnak - elvégzéséhez az orvosok úgynevezett DNS-mátrixokat - a fertőzések DNS-molekuláit - használják, amelyeken a későbbiekben DNS "klónozás" történik. Már említettük, hogy a fertőzés teljes DNS-ének jelenléte nem szükséges, ehhez a szakaszhoz elegendő a DNS-molekula egy kis darabja, amely csak erre a mikrobára jellemző (fertőzés).

A DNS-amplifikáció középpontjában, és ennek megfelelően a PCR-reakció teljes elvének középpontjában a DNS-kiegészítés természetes folyamata áll minden élőlény esetében - a DNS-replikáció, amelyet egyetlen DNS-lánc megkettőzésével hajtanak végre.

A DNS egyetlen fragmentumától kezdve a laboratóriumi orvos lemásolja, és láncreakcióban növeli a másolatok számát: az első ciklus után már 2 fragmentum van, a második ciklus után - 4, a harmadik után - 8, a negyedik után. - 16, majd 32 , 64, 128, 256... Minden ciklussal megduplázódik a példányszám, és húsz ciklus után milliókba, harminc után pedig milliárdokba megy a szám. A ciklus néhány percig tart, és egy nagyon kicsi kémiai reaktorban a hőmérsékleti rendszer bizonyos változására csökken. Itt elegendő mennyiségben oldatban megvan a szintézishez minden szükséges komponens, mindenekelőtt az A, G, T és C nukleotidok, valamint finom előkészítő kémiai műveleteket is végeztek, hogy azonnal pontos másolatot készítsenek minden kész DNS szakasz, majd ebből a másolatból - ismét egy másolat, ez az elágazó láncreakció.

A DNS-lánchoz primerek - a mikrobák DNS-éhez hasonló mesterségesen szintetizált DNS "darabok" (nukleotidpárok) kapcsolásával (fertőzés) - két rövid, két DNS szakaszból álló láncból álló hélix képződik, amelyek a szintézishez szükségesek. a jövő DNS-ének.

Egy új lánc szintézise a DNS két szálának mindegyikének befejezésével történik. Az amplifikációs folyamat egy adott hely - DNS-polimeráz - segítségével történik, amely a laboratóriumi módszer nevét adta. A polimeráz a reakció katalizátoraként működik, és figyeli a nukleotidbázisok egymás utáni kapcsolódását a növekvő új DNS-szálhoz.

Így a DNS-amplifikáció a DNS specifikus, azaz csak egy adott szervezetben rejlő másolatai számának többszörös növekedése. Nincs szükség a teljes DNS-lánc befejezésére ahhoz, hogy lássuk a fertőzés kórokozóját. Csak arra a területre van szükség, amely erre a baktériumra, mint egyedre jellemző.

5360 dörzsölje. Egy átfogó program költsége gasztroenterológussal

25% KEDVEZMÉNY KARDIOLÓGUS FOGLALÁSÁN

- 25%elsődleges
Orvoslátogatás
hétvégi terapeuta

5160 dörzsölje. 5420 rubel helyett. Férfiak vizsgálata urológiai fertőzésekre

ALLERGOLÓGIA 5120 dörzsölje. 5590 rubel helyett.

Az amplifikáció minden többszörösen ismétlődő lépése különböző hőmérsékleteken megy végbe. A PCR elemzéshez speciálisan programozható berendezést használnak - PCR - termosztátot vagy erősítőt, amely automatikusan változtatja a hőmérsékletet. Az amplifikációt egy előre meghatározott program szerint végezzük, amely megfelel az észlelt fertőzés típusának. A programtól és az észlelt fertőzés típusától függően az automatizált PCR folyamata 2-3 órát vesz igénybe.

A PCR diagnosztikában fontos szerepet játszik az elemzést végző laboráns végzettsége, ettől függ a PCR berendezés helyes beállítása, az eredmények értelmezése. Az Euromedprestige Medical Center orvosai nagy tapasztalattal rendelkeznek a DNS-diagnosztika elvégzésében, ami biztosítja a vizsgálat eredményeinek megbízhatóságát és garantálja a pozitív sikert a fertőző betegségek kezelésében. A PCR tesztek átadására és a fertőző betegségek teljes körű diagnosztizálására és kezelésére az "Euromedprestige" orvosi központunkban.

Az amplifikációs termékek kimutatása során a keletkező amplifikációs termékek keverékét elválasztják. Speciális oldatokat adnak a keverékhez, amelyek a DNS-fragmenseket fluoreszkáló képességgel ruházzák fel - narancsvörös világító csíkokat tükröznek. A kapott izzás vírusok, mikrobák vagy baktériumok DNS-ének jelenlétét jelzi a pácienstől PCR-elemzés céljából vett anyagban.

A PCR (polimeráz láncreakció) a molekuláris biológia vívmánya, a 20. század végén és a 21. század elején a klinikai laboratóriumi diagnosztika egyik fő módszere, amely nagy hasznot hoz az orvostudomány különböző területein.

Így még akkor is, ha az emberi test több millió sejtje között nem maga az élő vírus veszett el, hanem csak egy részecskék a DNS-éből, akkor a PCR, ha semmi nem zavarja, valószínűleg megbirkózik a feladattal és jelentést tesz a az „idegen” tartózkodása pozitív eredménnyel. Ez a PCR lényege és fő előnye.

Előnyök és hátrányok

A PCR diagnosztikát végző laboratórium a legmagasabb követelményeket támasztja a berendezések, a vizsgálati rendszerek és az egészségügyi személyzet képzettsége tekintetében. Ez egy csúcstechnológiás laboratórium, amely rendkívül érzékeny és nagyon specifikus reagensek arzenáljával rendelkezik, így nincs különösebb hátránya. Hacsak nem ad pozitív eredményt klinikai megnyilvánulások hiányában, és ezzel dilemma elé állítja a klinikust: érdemes-e elkezdeni a kezelést vagy sem?

A pácienst megfigyelő orvos kételkedni kezd a vizsgálati eredmények megbízhatóságában, mivel nem látja a betegség jeleit. De mégis, tekintettel a PCR rendszer nagy érzékenységére, nem szabad elfelejteni, hogy már a preklinikai stádiumban is kimutatja a kórokozót, és a pozitív eredmény ebben az esetben inkább előny, mint hátrány. Ennek alapján a kezelőorvosnak magának kell döntenie a terápia célszerűségéről, figyelembe véve egyéb pro és kontra érveket.

A polimeráz láncreakciót használó diagnosztika előnyei nyilvánvalóak:

• Magas specifitás eléri a 100%-ot, mivel a kiválasztott mintában egy adott szervezetben rejlő, de az embertől idegen nukleinsavrészecskék vannak jelen;
• Nagy teljesítményű, elvégre a PCR egy csúcstechnológiás automatizált technika, amely lehetőséget ad a vizsgálat elvégzésére az anyagmintavétel napján, és ezzel megszabadítja a pácienst a felesleges aggodalmaktól;
• A PCR egyetlen mintán dolgozva képes több vizsgálat elvégzésére és kb több kórokozó kimutatása ha ilyen feladata van. Például a chlamydia fertőzés diagnosztizálása során, ahol a PCR az egyik fő módszer, a chlamydia mellett a Neisseria (gonococcus) is kimutatható - a kórokozó. Ráadásul ez nem befolyásolja negatívan az eredmények megbízhatóságát;
• PCR vizsgálat veszélyes mikroorganizmus lappangási időszak amikor még nem volt idejük kézzelfogható károkat okozni a szervezetben, azaz korai diagnózis figyelmeztet a kóros folyamat közelgő fejlődésére, ami lehetővé teszi a felkészülést és a teljes fegyverzettséget.

Ezen túlmenően a diagnosztika során időnként felmerülő félreértések elkerülése érdekében a PCR azzal is védekezik, hogy eredményei rögzíthetők (fénykép, számítógép), hogy azokat szükség esetén szakértői célra felhasználhassák.

A PCR-válaszok normáját negatív eredménynek tekintik., amely az idegen nukleinsavak töredékeinek hiányát jelzi, a pozitív válasz fertőzés jelenlétét jelzi a szervezetben, a digitális értékek a vírus állapotát és koncentrációját jelzik a vizsgálat időpontjában. Az elemzés teljes átiratát azonban olyan orvos végzi, aki speciális képzésen esett át a "PCR" témában. Nincs értelme annak, hogy saját maga próbálja értelmezni az eredményeket, mivel lehetséges, hogy ez valószínűleg megtörténik, hogy félreérti és előre aggódik.

Mitől fél a PCR, mire képes, és hogyan lehet rá felkészülni?

Mint minden más tanulmánynál, néha a teszteredmények hamis pozitívak vagy hamis negatívak ahol a PCR sem kivétel. Ez a következő esetekben fordulhat elő:

1. A technológiai folyamat megsértése a reakció egyik szakaszában;
2. Az anyaggyűjtésre, tárolására vagy szállítására vonatkozó szabályok be nem tartása;
3. Idegen szennyeződések jelenléte az anyagban.

Ez arra utal, hogy a PCR-t - a fertőzések diagnosztizálását körültekintően, körültekintően és pontosan kell megközelíteni, ellenkező esetben az anyagminták szerkezeti felépítését megváltoztathatják, vagy akár össze is omolhatnak.

A PCR diagnosztika szakaszai. A hamis eredmények a vizsgálat bármely szakaszában megsérthetik

A fertőzések PCR diagnosztikája a többi laboratóriumi módszer mellett az "arany standardok" kategóriájába tartozik, így számos olyan betegség kórokozóinak felkutatására használható, amelyeknek első ránézésre semmi közük egymáshoz:

• Különféle lokalizációjú tuberkulózis, tüdőgyulladás (beleértve az atipikus, chlamydia által okozott);
• Gyermekkori fertőzések (kanyaró rubeola, parotitis, kanyaró);
• diftéria;
• szalmonellózis;
• Zoonózisos fertőző betegség - listeriosis (a betegséget különféle tünetek jellemzik, a nyirokcsomók, a központi idegrendszer, a belső szervek károsodásával);
• Az Epstein-Barr vírus behatolása által okozott betegségek ( Fertőző mononukleózis satöbbi.);
• Papillomavírus fertőzés által kiváltott onkológiai patológia (HPV és típusai);
• Borreliosis (Lyme-kór, kullancs-encephalitis);
• Helicobacter pylori fertőzés, melynek kórokozója az emberi gyomorban élő Helicobacter pylori baktérium. Bebizonyosodott, hogy a Helicobacter gyomor- vagy nyombélrák kialakulását okozza;
• és gyakorlatilag minden.

A szexuális úton terjedő fertőzések PCR diagnosztikája különösen fontos, mivel az így előidézett betegségek gyakran hosszú ideig klinikai megnyilvánulások nélkül zajlanak, de a terhesség alatt kezdenek aktívabbá válni, és ezáltal veszélyeztetik a gyermek egészségét, sőt életét. . És viselkedj hasonlóan. Némelyikük ("fáklya") egyidejűleg kapcsolódik az STI-khoz, így az utóbbiak részletesebb megfontolást igényelnek. A legnépszerűbb módszerekkel az olvasó a cikk következő részeiben ismerkedhet meg.

Hogyan kell megfelelően felkészülni a megbízható eredmény érdekében?

Azonnal megjegyezzük, hogy a PCR előkészítése meglehetősen egyszerű, nem különleges erőfeszítések a beteg részéről nem szükséges. Csak három egyszerű feladatot kell végrehajtania:

1. A teszt elvégzése előtt 24 órával ne éljen együtt;
2. A vénából származó vér felvételéhez és elemzéséhez éhgyomorra kell jönnie, mellesleg nem ihat sem;
3. A vizeletet éjszaka kell átadni (reggel - a gyógyszertárban előző nap vásárolt steril edényben).

A PCR bármilyen biológiai környezetben működhet

A PCR módszer nem „vérszomjas”, ezért bármilyen fertőző ágenst tartalmazó biológiai környezetet elfogad. a választás - mit kell venni a kutatáshoz, az az orvosnál marad.

Így a kórokozó keresése során a vérvizsgálaton kívül (bár az is megfelelő és a legtöbb esetben más anyaggal párhuzamosan is) használhatja:

• (az urogenitális traktus ürítése);
• A szájüreg, a kötőhártya, a nasopharynx, a nemi szervek nyálkahártyájának kaparása (nőknél a méhnyakból és a hüvelyből, férfiaknál a húgycsőből)
• nyál;
• sperma;
• prosztatalé;
• A placenta szövetei és a magzatvíz (magzatvíz);
• Vizelet üledék (centrifugálás után), például bizonyos STI-k és Mycobacterium tuberculosis kimutatására;
• Köpet és pleurális folyadék ugyanarra a célra;
• váladékok;
• A cerebrospinális folyadék a központi idegrendszer fertőző elváltozásának gyanúja esetén;
• A májból, nyombélből, gyomorból stb. vett biopsziás anyag (biopszia).

Hozzáteszem a fentiekhez, hogy minden esetben, még kaparékban, váladékban is lesz elegendő anyag a vizsgálathoz, hiszen a PCR vizsgálat nem igényel nagy mennyiséget, elég néhány mikroliter az elemzéshez, amit általában egy Eppendorf típusú mikrocsövet és tanulmányozásra küldték.

Betegségek és a PCR alkalmazása

A HIV és a polimeráz láncreakció

Általában, amikor az immunoblot pozitív eredménye névtelen vizsgálaton megy át, a diagnózist újra megismétlik. Ha a diagnózis megerősítést nyer, a beteg további vizsgálatokat ír elő:

1. Immunológiai reakciók segítségével meghatározzuk a CD 4 limfociták (immunkompetens sejtek - T-helperek vagy helperek) abszolút értékét, amelyet a fertőzés először megfertőz, majd elveszítik alapvető tulajdonságaikat, és nem tudnak különbséget tenni saját" és valaki másé. Elviszik a vérplazmában keringő vírus RNS-ét a szervezet normál sejtjeihez, és nem reagálnak rájuk;
2. A vírus RNS kimutatása PCR-rel és a vírusrészecskék koncentrációjának kiszámítása a kóros folyamat stádiumának, súlyosságának és prognózisának megállapítása érdekében ezen adatok alapján. Természetesen a „norma” szó ebben a vonatkozásban nem létezik, mivel a reakció mindig pozitív, a digitális értékek dekódolása pedig az orvos hatáskörébe tartozik.

PCR és hepatitis

A PCR módszerrel kimutathatók a kórokozók, leggyakrabban a tesztet a más módszerekkel rosszul kimutatható hepatitis C diagnosztizálására használják.

A hepatitis C vírus (RNS-tartalmú) viselkedésében az emberi szervezetben hasonlít a HIV-re. Beékelődve a májsejtek (hepatociták) genomjába, ott várakozik a szárnyakban, ami legalább 2 év múlva, legalább 20 év múlva jöhet, ezért az orvosok "szelíd gyilkosnak" nevezték. A hepatitis C rosszindulatú folyamat kialakulásához vezet a máj parenchymában, amely a későbbi szakaszokban nyilvánul meg. Az immunrendszer nem veszi észre ezeket az eseményeket, összetéveszti a vírust egy hepatocitával. Igaz, bizonyos mennyiségben a vírus elleni antitestek termelődnek, de nem adnak megfelelő immunválaszt. A hepatitis C diagnosztizálására az ELISA nem túl informatív, mivel azt jelzi, hogy a vírus nyomokat hagyott maga után, és nem tudni, hogy elhagyta-e magát. A HCV esetében ismertek az öngyógyító esetek, miközben a vírus elleni antitestek megmaradnak és keringenek egy életen át (immunológiai memória). A PCR észrevehetően megelőzi az antitestek képződését, és már 1-1,5 héten belül képes kimutatni a vírusrészecskét, míg az antitestek 2 hónap és hat hónap közötti tartományban jelenhetnek meg

Az emberi szervezetben burjánzó hepatitis C vírus gyanúja esetén a PCR diagnosztika a legoptimálisabb kutatási módszer, mert csak ez képes felismerni a „szelíd ellenség” jelenlétét a beteg vérében vagy májbiopsziájában.

Néha azonban vannak olyan esetek, amikor az AT pozitív, és a PCR eredménye negatív. Ez néha megtörténik, amikor a vírus mennyisége nagyon alacsony, vagy amikor a májban szunnyad anélkül, hogy bejutna a véráramba. Annak érdekében, hogy mégis megtalálják az igazságot, a pácienst újra elemzik, vagy akár többször is.

Papillomavírus fertőzés

Ha az öngyógyulás nem következik be, az is, anélkül, hogy megnyilvánulna, hosszú ideig fennmaradhat a gazdaszervezetben, ami nem is sejti, mivel PCR nem történt, és a betegség tünetei sem voltak. Azonban a papilloma jelenléte vírusos fertőzés, bár látens, korántsem közömbös az emberi egészség iránt, ahol bizonyos típusú vírusok okoznak onkológiai betegségek(16., 18. típus).

Gyakrabban a lakosság női fele szenved HPV-től, mivel a vírus jobban szereti a női nemi szerveket, és különösen a méhnyakot, ahol bizonyos vírustípusok hozzájárulnak a diszpláziás folyamatok kialakulásához, majd a méhnyakrák kialakulásához, ha nem diszplázia. kezelik, és a vírus kiszabadul. Tehát a polimeráz láncreakció kimutatja a vírus DNS-ét, majd jelzi a nő szervezetében megtelepedett „rossz” vagy „jó” (onkogén vagy nem onkogén) típust.

Egyéb STI-k és TORCH-fertőzések

Nyilvánvaló, hogy a polimeráz láncreakció bármilyen idegen, nukleinsavakból álló szerkezetet találhat, így ez a teszt minden STD és TORCH fertőzés kimutatására alkalmas, azonban nem mindig alkalmazzák. Miért kell mondjuk ilyen drága kutatásokat végezni a gonococcus kimutatására, ha vannak megfizethetőbbek és olcsóbbak?

A TORCH fertőzések és az STI-k annyira összefüggenek egymással, hogy néha nehéz meghatározni, hogy egy adott kórokozót melyik csoportba kell besorolni. Általában nehéz lehet megérteni őket, mivel ezek meglehetősen változatos mikroorganizmus-csoportok, amelyek mindig vagy csak bizonyos körülmények között (immunhiány) terjedhetnek, és csak a terhesség alatt lehetnek érdekesek, az esetleges negatív hatások miatt. lefolyása és a magzaton.

A látens fertőzések kimutatásának fő módszere a PCR

A klinikai megnyilvánulások kialakulásának alapja a különböző kórokozók, melyeket csak PCR-rel lehet megtalálni, ami annak fő feladata, esetenként ELISA-val együtt, hol pedig mint az egyetlen megerősítő vizsgálat, különösen, ha nincsenek a betegség tünetei. Ilyen nehéz helyzetet teremthet egy polimikrobiális fertőzés, amely a nyilvánvaló kórokozók mellett opportunista kórokozókat is tartalmaz.

Az ureaplazma gyakran a mikoplazmával párhuzamosan fordul elő.És ez nem véletlen. Ezek a fajok, akárcsak a chlamydia, sem nem vírusok, sem nem baktériumok, sejtek belsejében élnek, és az STI-k közé tartoznak, bár jelenlétük egészséges szervezetben sem ritka. Tehát az egészséges hordozó és a beteg személy megkülönböztetéséhez speciális módszerekre van szükség, ahol a PCR-t a legmegbízhatóbbnak tekintik, mivel e mikroorganizmusok szerkezetének és viselkedésének sajátosságai miatt más vizsgálatok nem hatékonyak.

Ami az (1., 2. típusú) és a szintén a herpeszvírusokhoz tartozó (5. típusú) vírusokat illeti, itt is kétértelmű a helyzet. A világ népességének fertőzöttsége megközelíti a 100%-ot, ezért ebben az esetben nagyon fontos a vírus azonosítása és annak dózisa, ami különösen fontos a terhesség alatt, mert egy felnőtt számára a vírus, amely gyökeret vert a test gyakran nem okoz gondot, és nem ad betegség jeleit.

Ezért nem szabad figyelmen kívül hagyni az orvos által felírt ilyen vizsgálatot, mert bizonyos esetekben a polimeráz láncreakció a laboratóriumi diagnosztika kötelező és szükséges módszere, amely nemcsak egy nőt, hanem egy kicsi, meg nem született férfit is megóvhat a súlyos szövődményektől.

Végezetül szeretném megjegyezni, hogy egy ilyen csodálatos módszer, mint a PCR, több mint 30 éve szolgálja az emberiséget. A vizsgálat feladatai ugyanakkor nem korlátozódnak a fertőző betegségek kórokozóinak felkutatására. A molekuláris biológia talaján megszületett polimeráz láncreakció elválaszthatatlanul összefügg a genetikával, sikeresen alkalmazzák a törvényszéki személyazonosításra, az igazságügyi orvostanban az apaság megállapítására, az állatorvoslásban, ha az állatklinikának van lehetősége drága berendezések beszerzésére, valamint egyéb területeken (ipar, mezőgazdaság stb.).

Videó: PCR - lényeg és alkalmazás

A PCR-elemzés egy modern és rendkívül pontos diagnosztikai módszer, amely lehetővé teszi a fertőzés kórokozójának azonosítását, függetlenül a patológia stádiumától. Ma ezt a vizsgálati módszert tartják a legmegbízhatóbbnak, mivel a magas specifikusság miatt kizárja a hamis adatok beérkezését.

A PCR módszer lényege

PCR elemzés - polimeráz láncreakció, amely lehetővé teszi a mikrobiális környezet térfogatának ismételt növelését és a kórokozó meghatározását. A PCR-jelenséget a XX. században fedezte fel Kary Mullis amerikai tudós, aminek köszönhetően a pontos diagnózis felállításának ideje jelentősen lecsökkent, és ennek következtében az orvosok gyorsabban kezdték előírni a megfelelő terápiás intézkedéseket.

A PCR-elemzés lényege, hogy a páciens biológiai mintáiból (vizelet, vér, nyál és mások) nyert kórokozó DNS-fragmenseit megsokszorozzák. Ez a technika lehetővé teszi a genetikai anyag bizonyos szakaszainak mesterséges környezetben történő növelését speciális enzimek segítségével, ráadásul a vizsgált fragmentumok száma olyan mértékben megnő, hogy azok vizuálisan is megvizsgálhatók.

Megjegyzendő, hogy a PCR-elemzés során csak bizonyos régiókat másolnak le, amelyek fontos szerepet játszanak a diagnózisban. Ha elhanyagolható mennyiségben vannak jelen a páciens szervezetében, akkor ez az elemzés képes lesz azonosítani őket.

A PCR technikát aktívan használják az orvosi gyakorlatban a fertőző és örökletes betegségek, mert amellett, hogy egyszerűen növeli a genetikai anyag mennyiségét (amplifikáció), lehetővé teszi az egyes DNS-fragmentumok összeillesztését és mutációk beiktatását, ellenőrzést gyakorolva az aggodalomra okot adó gének felett.

Mit mutat a PCR elemzés?

A PCR-elemzést széles körben alkalmazzák az orvostudomány különböző területein. Természetesen a leggyakrabban a nőgyógyászatban és az urológiában alkalmazzák, de a technika a tüdőgyógyászatban, phthisiologyban, gasztroenterológiában, onkológiában és más területeken is releváns.

A PCR elemzés képes kimutatni a vírusokat különböző szakaszaiban betegségek esetén képes kimutatni a látens vagy "alvó" mikroorganizmusokat is, amelyek nem okoznak klinikai tüneteket:

• Különböző típusú humán papillomavírus (HPV);
• Chlamydia;
• Trichomonas;
• A gonorrhoea kórokozója;
• mikoplazmák;
• Ureaplasma;
• Gardnerella;
• Candida gomba;
• Microbacterium tuberculosis;
• Hepatitis A, B és C vírusok;
• helicobacteriumok;
• herpeszvírusok;
• citomegalovírusok (CMV);
• Epstein-Barr vírusok.

A PCR elemzés előnyei

1. Az elemzés nagy pontossága: minimális a hamis negatív eredmények megszerzésének kockázata;
2. A technika sajátosságai: A PCR-elemzés lehetővé teszi egy adott fertőző ágens, annak típusának és típusának izolálását;
3. Túlérzékenység: a PCR-elemzés a mikroorganizmus néhány DNS-fragmensét is kimutatja;
4. A test különböző biológiai környezeteinek tanulmányozásának lehetősége;
5. Az eredmények megszerzésének sebessége: az eljárás után 4-5 órával érhetők el;
6. Több mikroorganizmus kimutatásának lehetősége egy biológiai anyagmintából.

A PCR-elemzést a különböző szakterületek orvosai aktívan használják, míg más diagnosztikai módszerek háttérbe szorulnak. Érdemes megjegyezni, hogy ez az eljárás lehetővé teszi a fertőzés hordozóinak és a betegség látens formáinak azonosítását, amelyekben nincsenek klinikai megnyilvánulások, de ezek a kórokozók negatívan befolyásolják a szervezet általános állapotát és működését, és a betegek veszélyt jelentenek a betegségre. mások.

PCR elemzés elkészítése és lebonyolítása

A mikroorganizmusok DNS-ének töredékei a páciens különböző biológiai környezeteiben találhatók. Az orvosok maguk határozzák meg a PCR-elemzéshez szükséges anyagok felvételének területeit, amelyek a betegség típusától és lokalizációjától függenek. Ha venerológushoz fordult a nemi úton terjedő fertőzések (STI-k) azonosítása érdekében, akkor megvizsgálják a nemi szervek folyását (a méhnyakból, hüvelyből származó kenet vagy kaparás) és a húgycső, valamint a vér és a vizelet.

A herpeszfertőzéseket és a mononukleózist a páciens szájüregéből származó kenetek elemzése alapján diagnosztizálják. A CMV-t vizelet, cerebrospinális folyadék vizsgálata után igazolják. A pulmonológiai osztályon köpetet és a pleurális üreg tartalmát veszik PCR-elemzés céljából. Terhes nőknél méhen belüli magzati fertőzés gyanúja esetén a magzatvíz és a méhlepény szöveteinek vizsgálata történik.

A hibás eredmények lehetőségének kiküszöbölése és a PCR-elemzés pontosságának növelése érdekében a biológiai anyag benyújtása előtt egyszerű ajánlásokat kell követni:

• A mikrobák többsége a vizelettel kimosódik, ezért nem szabad vizelni, mielőtt kenetet venne a húgycsőből;
• 3-5 napon belül tartózkodnia kell a nemi érintkezéstől;
• A PCR-elemzést nem közvetlenül a menstruációs áramlás megszűnése után végezzük, várjon 5-7 napot;
• 4 órával a nyáladás előtt abba kell hagyni a gyógyszerek és az élelmiszerek szedését, és az eljárás előtt ajánlatos a szájat vízzel öblíteni, és enyhe masszázst végezni az arc területén;
• A vizeletet reggel steril edénybe kell gyűjteni, az anyag szennyeződésének elkerülése érdekében levétel előtt le kell mosni, nőknek steril pálcikát kell helyezni a hüvelybe, férfiaknak pedig a fityma redőzését annyival késleltetni. amint lehetséges;
• Egy nappal az anyag kiszállítása előtt tartózkodnia kell az alkoholfogyasztástól, a fűszeres ételektől és a forró eljárásoktól (szauna, fürdő stb.);
• 2 héttel a PCR elemzés előtt le kell állítani az antibakteriális szerek szedését;
• Egy héttel a vizsgálat előtt felfüggesztjük az intim gélek, kenőcsök és hüvelykúpok használatát.

Ezek meglehetősen egyszerű szabályok, de segítenek a legmegbízhatóbb eredmények elérésében, és csökkentik a diagnosztikai hibák kockázatát.

A PCR elemzés megfejtése

A PCR teszt eredménye pozitív vagy negatív lehet. A negatív teszteredmény a fertőzés hiányát jelzi a biológiai anyagokban.

A pozitív eredmény megerősíti a mikroorganizmusok jelenlétét, de számuk információi szükségesek a pontos diagnózishoz. Valójában testünkben vannak olyan opportunista mikrobák, amelyek csak az aktív növekedés és szaporodás eredményeként válnak betegségek okozóivá. A PCR elemzés kvantitatív adatai alapján az orvos megtudhatja a kóros folyamat fejlődési stádiumát, aktivitását, kiválaszthatja a specifikus. gyógyszerés az adagolását.

PCR elemzés terhesség alatt

A terhesség egy különleges időszak minden nő életében. Jelenleg számos STI vagy látens fertőzés rendkívül veszélyes lehet a baba számára, és koraszülést, vetélést, fejlődési rendellenességeket és fejlődési rendellenességeket okozhat. Ezért a PCR-elemzést minden terhes nőnél tervszerűen, főként a korai szakaszban (12 hétig), de néha a 2. trimeszterben is előírják.

Az anyagot a nyaki csatornából és a húgycsőből veszik, az eljárás fájdalommentes és nem jelent veszélyt. A legtöbb esetben a PCR-elemzést chlamydia, ureaplasma, mycoplasma, citomegalovírus, herpesz és HPV esetében végzik. Ezek a mikroorganizmusok jelentenek veszélyt a terhesség alatt. De néha a nők átfogó PCR-elemzésen esnek át, amely nagyszámú (12 vagy több) mikroorganizmus vizsgálatát is magában foglalja.