Interferóny, povaha, spôsoby výroby a použitia. Syntéza rôznych tried ľudského interferónu v geneticky upravených mikrobiálnych bunkách

Plesne sú producentmi antibiotík. Vlastnosti bunkovej štruktúry a vývojového cyklu počas fermentácie. Antibiotiká produkované plesňami.

Biotechnológia (Bykov 2009) s.28-40.

Plesne, alebo plesnivec- rôzne huby (hlavne zygo- a askomycéty) tvoriace rozvetvené mycéliá bez veľkých plodníc ľahko viditeľných voľným okom.

Rodiny a typy foriem

Penicillium spp.
Aspergillus
Moniliaceae
Dematiaceae
Fusarium
Acremonium
Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae)
Onychocola canadensis

Distribúcia v prírode

Plesne sú všadeprítomné. V podstate rozsiahle kolónie rastú na teplých, vlhkých miestach, v živných pôdach.

Kmeň(z nemčiny. Stammen, doslova - stať sa) - čistá kultúra vírusov, baktérií, iných mikroorganizmov alebo bunková kultúra izolovaná v určitom čase a v určité miesto. Pretože mnohé mikroorganizmy sa rozmnožujú mitózou (delením), bez účasti pohlavného procesu, druhy takýchto mikroorganizmov v podstate pozostávajú z klonálnych línií, ktoré sú geneticky a morfologicky identické s pôvodnou bunkou. Kmeň nie je taxonomickou kategóriou; najnižší taxón vo všetkých organizmoch je druh;

Priradenie mikroorganizmu ku konkrétnemu druhu je založené na pomerne širokých charakteristikách, ako je typ nukleovej kyseliny a štruktúra kapsidy vo vírusoch; schopnosť rásť na určitých uhľovodíkoch a typ uvoľnených metabolických produktov, ako aj konzervované sekvencie genómu v baktériách. V rámci druhu existujú rozdiely vo veľkosti a tvare plakov (negatívne „kolónie“ vírusu) alebo kolónií mikroorganizmu, úrovne produkcie enzýmov, prítomnosti plazmidov, virulencie atď.

Neexistuje žiadna celosvetovo akceptovaná nomenklatúra na pomenovanie kmeňov a používané názvy sú celkom ľubovoľné. Spravidla sa skladajú z jednotlivých písmen a číslic, ktoré sa píšu za názvom druhu. Napríklad jeden z najznámejších kmeňov E. coli je E. coli K-12.

Plesne sú široko používané ľuďmi.

Kmene húb Aspergillus niger používané na výrobu kyselina citrónová z cukrových látok
Kmene Botrytis cinerea(„Ušľachtilá hniloba“) sa podieľa na dozrievaní niektorých vín (sherry).
Iné druhy foriem (tzv. „ušľachtilá pleseň“) sa používajú na výrobu špeciálnych druhov syrov (Roquefort, Camembert).
Pleseň často postihuje plodnice jedlých húb a robí ich nevhodnými na zber. Niekedy sa však takéto huby stávajú špeciálnymi predmetmi lovu húb, pozri o „homároch“ v článku Hypomyces lactifluorum.

Škody spôsobené plesňami

Nebezpečenstvo pre ľudí

Mykotoxíny a antibiotiká

Mnohé plesne produkujú sekundárne metabolity – antibiotiká a mykotoxíny, ktoré majú depresívny alebo toxický účinok na ostatné živé organizmy. Najznámejšie sú nasledujúce látky

Mykotoxíny:

Aflatoxín

antibiotiká:

penicilín
Cefalosporíny
cyklosporín

Mnohé antibiotiká sú nútené používať v koncentráciách blízkych toxickým. Antibiotiká gentamicín, streptomycín, dihydrostreptomycín, kanamycín a iné môžu mať teda nefro- a ototoxické účinky.

Patogény

Niektoré plesne môžu spôsobiť ochorenia zvierat a ľudí – aspergilózu, onychomykózu a iné.

Plesne a poľnohospodárstvo

Niektoré plesne, hoci výrazne znižujú úrodu, môžu mať nepriaznivý vplyv na zdravie hospodárskych zvierat.

Plesne napádajú zásoby obilia, krmoviny, slamu a seno. Niekedy sa produkty stanú nepoužiteľnými v dôsledku toxicity metabolitov húb.

Pri silnom rozvoji plesňových húb v slame je možné samozahrievanie a rovnomerné vznietenie stohov.

Mechanizmy odporu

Mikroorganizmus nemusí mať štruktúru, na ktorú antibiotikum pôsobí (napríklad baktérie rodu Mycoplasma (lat. Mykoplazma) sú necitlivé na penicilín, pretože nemajú bunkovú stenu);
Mikroorganizmus je pre antibiotikum nepriepustný (väčšina gramnegatívnych baktérií je voči penicilínu G imúnna, pretože bunková stena je chránená dodatočnou membránou);
Mikroorganizmus je schopný premeniť antibiotikum na neaktívnu formu (veľa stafylokokov (lat. Staphylococcus obsahujú enzým β-laktamáza, ktorý ničí β-laktámový kruh väčšiny penicilínov)
V dôsledku génových mutácií sa metabolizmus mikroorganizmu môže zmeniť tak, že reakcie blokované antibiotikom už nie sú pre život organizmu kritické;
Mikroorganizmus je schopný pumpovať antibiotikum z bunky [ zdroj neuvedený 85 dní] .

Aplikácia

Antibiotiká(zo starogréčtiny ἀντί - proti - proti, βίος - bios - život) - látky prírodného alebo polosyntetického pôvodu, ktoré potláčajú rast živých buniek, najčastejšie prokaryotických alebo prvokov.

Podľa GOST 21507-81 (ST SEV 1740-79)

Antibiotikum je látka mikrobiálneho, živočíšneho alebo rastlinného pôvodu, ktorá môže potlačiť rast mikroorganizmov alebo spôsobiť ich smrť.

Antibiotiká prírodného pôvodu produkujú najčastejšie aktinomycéty, menej často nemycéliové baktérie.

Niektoré antibiotiká majú silný inhibičný účinok na rast a rozmnožovanie baktérií a zároveň nespôsobujú relatívne malé alebo žiadne poškodenie buniek makroorganizmu, a preto sa používajú ako liečivá.

Niektoré antibiotiká sa používajú ako cytostatiká (protinádorové) lieky pri liečbe rakoviny.

Antibiotiká neovplyvňujú vírusy, a preto sú nepoužiteľné pri liečbe ochorení spôsobených vírusmi (napríklad chrípka, hepatitída A, B, C, ovčie kiahne, herpes, rubeola, osýpky).

Terminológia

Úplne syntetické lieky, ktoré nemajú žiadne prírodné analógy a majú inhibičný účinok na rast baktérií podobný antibiotikám, sa tradične nazývajú nie antibiotikami, ale antibakteriálnymi chemoterapeutickými liekmi. Najmä, keď boli medzi antibakteriálnymi chemoterapeutickými liekmi známe iba sulfónamidy, bolo zvykom hovoriť o celej triede antibakteriálnych liekov ako o „antibiotikách a sulfónamidoch“. V posledných desaťročiach sa však vďaka vynájdeniu mnohých veľmi silných antibakteriálnych liekov na chemoterapiu, najmä fluorochinolónov, ktoré sú blízke alebo prevyšujú aktivitu „tradičných“ antibiotík, pojem „antibiotikum“ začal rozmazávať a rozširovať. v súčasnosti sa často používa nielen vo vzťahu k prírodným a polosyntetickým zlúčeninám, ale aj k mnohým silným antibakteriálnym liekom na chemoterapiu.

Syntéza rôznych tried ľudského interferónu v geneticky upravených mikrobiálnych bunkách. Expresia génov uložených v plazmide.

Cytokíny sú skupinou polypeptidových mediátorov medzibunkovej interakcie, ktoré sa primárne podieľajú na tvorbe a regulácii obranných reakcií organizmu pri zavádzaní patogénov a narušení integrity tkaniva, ako aj pri regulácii množstva normálnych fyziologických funkcií. Cytokíny môžu byť rozdelené do nového nezávislého regulačného systému, ktorý existuje spolu s nervovým a endokrinným systémom na udržanie homeostázy a všetky tri systémy sú úzko prepojené a vzájomne závislé.

História štúdia cytokínov sa začala v 40. rokoch dvadsiateho storočia. Vtedy boli opísané prvé účinky kachektínu, faktora prítomného v krvnom sére a schopného spôsobiť kachexiu alebo stratu telesnej hmotnosti. Následne sa tento mediátor izoloval a preukázalo sa, že je identický s tumor nekrotizujúcim faktorom (TNF). Počas posledných dvoch desaťročí boli klonované gény väčšiny cytokínov a boli získané rekombinantné analógy, ktoré úplne replikujú biologické vlastnosti prirodzených molekúl. V súčasnosti je známych viac ako 200 jednotlivých látok patriacich do rodiny cytokínov.

Cytokíny zahŕňajú interferóny, faktory stimulujúce kolónie (CSF), chemokíny, transformujúce rastové faktory; faktor nekrózy nádorov; interleukíny s historicky stanovenými sériovými číslami a niektoré ďalšie endogénne mediátory. Interleukíny, ktoré majú sériové čísla začínajúce od 1, nepatria do rovnakej podskupiny cytokínov príbuzných spoločnými funkciami. Tie možno zase rozdeliť na prozápalové cytokíny, rastové a diferenciačné faktory lymfocytov a jednotlivé regulačné cytokíny.

Klasifikácia cytokínov sa môže uskutočniť podľa ich biochemických a biologických vlastností, ako aj podľa typov receptorov, prostredníctvom ktorých cytokíny vykonávajú svoju činnosť. biologické funkcie. Nižšie je uvedená kombinovaná štrukturálna a funkčná klasifikácia, kde sú všetky cytokíny rozdelené do skupín, pričom sa primárne berie do úvahy ich biologická aktivita, ako aj vyššie uvedené štruktúrne vlastnosti molekúl cytokínov a ich receptorov [Simbirtsev A.S., 2004].

Klasifikácia cytokínov

1. Interferóny typu I (IFN a,b,d,k,w,t, IL-28, IL-29 (IFN 1));

2. Faktory stimulujúce kolónie, hematopoetíny:

– faktor kmeňových buniek;

– gp140 ligandy (IL-3, IL-5, GM-CSF);

- Erytropoetín, trombopoetín.

3. Rodina tumor nekrotizujúcich faktorov (TNF, lymfotoxíny α a β);

4. Superrodina interleukínu-1 a fibroblastového rastového faktora (FGF):

– rodina FRF

– rodina IL-1 (IL-1α, IL-1β, IL-33 atď.).

5. Rodina interleukínu-6 (IL-6, IL-11, IL-31).

6. Rodina interleukínu-10 (IL-10,19,20,22,24,26)

7. Rodina interleukínu-12 (IL-12,23,27)

8. Cytokíny T-helper klonov a regulačné funkcie lymfocytov (IL-2, IL-4-5, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-21, IFNg)

9. Rodina interleukínu 17 (IL-17A, B, C, D, E, F)

10. Chemokíny.

11. Faktory rastu:

– Nadrodina nervového rastového faktora, rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek a transformujúcich rastových faktorov

– skupina epidermálnych rastových faktorov (ERF, TRFα atď.);

– Skupina inzulínu podobných rastových faktorov (IGF-I, IGF-II).

Cytokíny môžu byť izolované do nového nezávislého systému na reguláciu základných funkcií tela, ktorý existuje spolu s nervovou a endokrinnou reguláciou a primárne súvisí s udržiavaním imunitnej homeostázy počas zavádzania patogénov a narušenia integrity tkaniva. V rámci imunitného systému cytokíny sprostredkovávajú obojsmerný vzťah medzi faktormi nešpecifická ochrana a špecifická imunita.

IN klinickej praxi Existujú tri hlavné použitia cytokínov:

1. cytokínová terapia na aktiváciu obranných reakcií organizmu, imunomoduláciu alebo doplnenie nedostatku endogénnych cytokínov;

2. anticytokínová imunosupresívna terapia zameraná na blokovanie biologických účinkov cytokínov a ich receptorov;

3. cytokínová génová terapia za účelom zvýšenia protinádorovej imunity alebo korekcie genetických defektov v cytokínovom systéme.

Cytokíny sa v klinickej praxi používajú na systémové aj lokálne použitie. Systémové podávanie má opodstatnenie v prípadoch, keď je potrebné zabezpečiť pôsobenie cytokínov vo viacerých orgánoch pre efektívnejšiu aktiváciu imunitného systému alebo aktiváciu cieľových buniek umiestnených v rôznych častiach tela. V súčasnosti našli najväčšie klinické uplatnenie cytokíny zo skupiny interferónov (IFN), predovšetkým alfa-IFN a beta-IFN, v menšej miere gama-IFN.

Interferóny sú skupinou proteínov s antivírusovým účinkom, ktoré produkujú eukaryotické bunky v reakcii na zavedenie množstva biologických činidiel - interferonogénov (RNA genómové vírusy, dvojvláknová RNA, rôzne polyanióny, bakteriálny LPS).

IFN spôsobujú rôzne účinky, ktoré sa prejavujú na bunkovej aj systémovej úrovni. IFN sa vyznačuje prítomnosťou troch hlavných účinkov – nešpecifického protivírusového, protinádorového a imunomodulačného. Interferóny inhibujú reprodukciu mnohých vírusov. Antivírusový účinok interferónu je založený na potlačení spojenia vírusovej RNA s bunkovými ribozómami, čo znemožňuje reprodukciu vírusu v bunke.

V 70-tych rokoch boli všetky IFN rozdelené na 2 typy: tie, ktoré sú indukované vírusmi (leukocyty a fibroblasty), ktoré boli klasifikované ako prvý typ, a tie, ktoré sú indukované mutagénmi (imunitné), ktoré boli klasifikované ako druhé. V súčasnosti táto klasifikácia stratila svoj význam. V roku 1980 komisia expertov Svetovej zdravotníckej organizácie prijala a odporučila na používanie klasifikáciu, podľa ktorej sú všetky ľudské IFN rozdelené do 3 tried. Sú kódované rôznymi génmi a majú sekvenciu aminokyselín charakteristickú pre každú triedu, z ktorej sú postavené ich molekuly. Keď sú dostupné rekombinantné IFN varianty, sú zvyčajne označené rímskymi písmenami.

Tabuľka 11 - Klasifikácia ľudských interferónov

V súčasnosti možno všetky poznatky získané o IFN zovšeobecniť do vedy „interfenológia“, ktorá zahŕňa teoretické a praktické (medicínske a farmaceutické) aspekty tohto problému. V poslednom desaťročí sa v interfenológii udiali 4 najdôležitejšie udalosti (vyzdvihnuté prof. F.I. Ershovom, 1996):

Bol sformulovaný koncept „interferónového systému“ a boli identifikované jeho priame a inverzné spojenia s imunitným systémom a neuroendokrinným systémom;

Bolo objavené množstvo IFN-ct génov (viac ako 20 v ľudských bunkách);

Pomocou moderných technologických techník sa zdokonalili existujúce IFN preparáty a vytvorila sa nová generácia, testovali sa pôvodné IFN induktory;

Boli stanovené indikácie a kontraindikácie pre klinické použitie IFN a ich induktorov pri vírusových a nevírusových ochoreniach.

Vakcinačný kmeň vírusu pseudomoru hydiny alebo Sendai vírus sa používa ako induktor interferonogenézy. Predbežná kultivácia vírusov sa uskutočňuje vo vývojových dňoch 9.-11. kuracie embryá. Základné technologické operácie: ovoskopia, utratenie, inkubácia kuracích embryí, zavedenie infekčnej suspenzie do alantoidnej dutiny, následná inkubácia 48-72 hodín a odstránenie infikovanej tekutiny z mŕtvych kuracích embryí. Alantoická tekutina obsahujúca vírus sa odstredí

Veľmi dôležitou operáciou, ktorá určuje kvalitu hotového produktu, je odstránenie nečistôt z červených krviniek z koncentrátu leukémie (1. etapa). Prítomnosť erytrocytov v leukemickom koncentráte je úplne eliminovaná ich selektívnou lýzou roztokom chloridu amónneho vo fyziologickej koncentrácii.

Tabuľka 12 - Technologická schéma biosyntézy IFN-a

Technologické štádium	Podmienky
1. Izolácia leukocytov	Frakcionácia leukomasy s dextra-
	nom a polyvinylalkohol s po-
	fúkacia hemolýza. To vytvára 3
	vrstva. Horné 2 vrstvy sa odstredia
	trávenie a resuspendovanie sedimentu v
	živné médium.
2. Naplnenie (aktivácia	Leukocyty 10-20 miliónov/ml v médiu č. 199 s
metabolizmus leukocytov) -	5 % darovanej krvnej plazmy, 3 jednotky/ml,
2-10 hodín, 37,5 °C	0,0015 jednotiek/ml inzulínu, 200 IU/ml natívneho
	IFN
3. Zavedenie induktorového vírusu
3.1. Indukcia 1 hodina, 37,5 °C	Vírus pseudomoru hydiny (NDV), dávka 5
	RCC 50 na 1 leukocyt
3.2.Oddelenie nevstrebateľného	Odstreďovanie 600x d- 15 minút.,
padnutý vírus	zber indukovaného bunkového sedimentu.
4. Biosyntéza 18 h, 37,5 °C	Suspenzná kultúra Leukocytov 6 miliónov/ml v médiu č. 199 s 5 % gamaglobulínovej plazmy, 5 ml sukcinátu sodného, hydrogenuhličitanu sodného do pH 7,5, antibiotiká. Výťažok IFN-a je 3-4 IU na 1 000 leukocytov.
5.Inaktivácia vírusu interferónu	Úprava pH média na 2,2-2,4 a vystavenie polotovaru po dobu aspoň 7 dní.
6. Purifikácia interferónu	Krok za krokom: čírenie, ultrafiltrácia, sterilizačná filtrácia

V štádiu kultivácie leukocytov (2. štádium) sa leukocytový koncentrát resuspenduje v kultivačnej tekutine, ktorá okrem hlavných zložiek obsahuje niektoré proteíny krvného séra, bez ktorých biosyntéza IFN prakticky neprebieha. Tiež sa zistilo, že pri kultivácii leukocytov, najmä pri vysokej hustote suspenzie (107 buniek/ml), sa v nich aktivujú metabolické procesy, čo je sprevádzané tvorbou kyslých produktov. V tomto smere je dôležité udržiavať pH prostredia v optimálnych medziach počas obdobia primingu a biosyntézy IFN. Na udržanie pH média na požadovanej úrovni sa do média pridávajú rôzne látky s pufrovacou kapacitou.

Optimálne podmienky počas produkcie IFN (štádium 4) vznikajú kultiváciou leukocytov pri 37-37,5°C. Zníženie inkubačnej teploty na 35 °C a menej, alebo naopak zvýšenie na 38 °C a viac viedlo k výraznému oslabeniu produkcie IFN.

IFN-a môže byť produkovaný ako za stacionárnych kultivačných podmienok, tak aj v kultúrach s konštantným miešaním buniek. Predpokladá sa, že suspendované bunky produkujú IFN-a intenzívnejšie. Veľký význam pre prežitie buniek v suspenzných kultúrach má tvar ciev, výška tekutej vrstvy a dostatočné množstvo kyslíka v vzdušné prostredie. Optimálne podmienky na získanie titrov IFN-a sa vytvárajú kultiváciou leukocytov v bankách s guľatým dnom, pokrytých fóliou, do polovice naplnených bunkovou suspenziou, za stáleho miešania. Predbežné ošetrenie leukocytov malými dávkami IFN-a viedlo k zvýšeniu výťažku IFN 3-10 krát.

Po resuspendovaní sa leukocyty indukujú alantoickými (neobalenými) vírusmi Newcastle alebo Sendaiovej choroby. Po 20-hodinovej inkubácii pri 37,5 °C, počas ktorej je primárne dôležité udržiavať životaschopnosť kultúry a vysoký metabolizmus buniek pri konštantnom pH, sa bunky oddelia 40 minútovou centrifugáciou pri nízkej rýchlosti (2000 ot./min.). Aktivita interferónu v prípravkoch získaných ako výsledok opísaného postupu je 30-200 000 U/ml.

V modernej biotechnológii sa stále viac využívajú metódy genetického inžinierstva. Už v mnohých laboratóriách po celom svete sa úspešne získavajú gény kódujúce tvorbu množstva biologicky aktívnych látok a integrujú sa do genetického aparátu kultivovaných bakteriálnych alebo somatických buniek.

Funkčné gény pre biotechnologickú produkciu sú znovu vytvorené reverznou transkripciou alebo syntetizované z jednotlivých nukleotidov, izolovaných z DNA zodpovedajúcich chromozómov.

Experimenty s prenosom ľudských IFN génov do bakteriálnych buniek sa začali koncom 70. rokov. Takmer súčasne v 3 výskumných skupinách: na Ústave molekulárnej biológie I Univerzity v Zürichu pod vedením Weissmanna, na oddelení biochémie Inštitútu pre výskum rakoviny v Tokiu pod vedením T. Taniguchiho a v USA. , pobočka Genentechu pod vedením J. Goeddela.

Všetky tri výskumné skupiny použili na klonovanie reverznú transkripciu interferónovej mRNA. Ako príklad sa pozrime na priebeh experimentov Weismanovej skupiny.

Na klonovanie génu IFN-a sa ako východiskový materiál použila frakcia 12S poly(A) mRNA (messenger adenylovaná RNA) získaná z leukocytových buniek indukovaných Sendai vírusom. Na základe messengerovej RNA bola získaná komplementárna DNA pozostávajúca z 2 reťazcov. Výsledná dvojvláknová DNA sa štiepila s použitím reštrikčných enzýmov za vzniku oligo-dG lepivého konca. Podobná operácia sa uskutočnila s plazmidom za vzniku lepivého oligo-dC konca. Pomocou ligáz bola komplementárna DNA obsahujúca informácie o štruktúre IFN-a vložená do plazmy pBR322.

Tento plazmid nesie gény, ktoré určujú rezistenciu na dve antibiotiká: tetracyklín a ampicilín. Inzercia interferónovej DNA inaktivuje gén zodpovedný za rezistenciu na ampicilín, takže primárna selekcia buniek, ktoré dostali hybridné plazmidy, bola založená na rezistencii na tetracyklín.

Na výber požadovaných klonov sa použila nasledujúca metóda: zmes niekoľkých plazmidov z rôznych klonov, z ktorých jeden môže obsahovať interferónovú DNA, sa denaturuje a naviaže sa na pevný podklad. Vzorky RNA získané z ľudských buniek produkujúcich IFN sa hybridizujú s touto DNA, filtre sa premyjú, RNA sa eluuje za denaturačných podmienok a eluát sa vstrekne do oocytov africkej zelenej žaby na detekciu mRNA interferónu. Spomedzi hybridizujúcich klonov sa vybral jeden s názvom Hif-2h, ktorý má inzert zodpovedajúci veľkosti kompletného génu IFNa.

Bunky Escherichia coli obsahujúce hybridné plazmidy nesúce takýto inzert sú schopné syntetizovať polypeptid s biologickou aktivitou interferónu.

Práca na klonovaní interferónových génov bola opakovaná a rozvíjaná vyššie uvedenými autormi a ďalšími skupinami výskumníkov v mnohých krajinách. V ZSSR bolo v roku 1982 opísané prvé úspešné klonovanie génu pre leukocytový interferón. akad. Ovchinnikov, fibroblast v roku 1983 - Yu.I. Kozlov, imúnny - v roku 1985 E.D. Sverdlov.

V súčasnosti sú gény IFN exprimované nielen v bunkách Escherichia coli, ale aj v bunkách iných gramnegatívnych baktérií (Pseudomonas) - to tvorí základ priemyselnej výroby IFN v Rusku. V súčasnosti sa verí, že najefektívnejšie využitie kvasníc na tieto účely.

Kvasinky rodu Saccharomyces nie sú pre človeka patogénne, s ich používaním majú stáročné skúsenosti. Kvasinky nepodliehajú lýze ani autolýze, ľahko sa oddeľujú a používajú lacné substráty. Biomasa kvasiniek neobsahuje toxické a pyrogénne faktory, ako bunky gramnegatívnych baktérií.

Veľmi dôležitou okolnosťou je aj podobnosť sekrečných mechanizmov kvasiniek a vyšších eukaryotov, čo naznačuje, že klonované preinterferónové gény budú schopné v dôsledku správneho spracovania produkovať zrelý IFN.

Bola vyvinutá technológia hromadnej kultivácie rekombinantných buniek produkujúcich IFN. Takže pre domácu drogu Reaferon zahŕňa:

kultivácia bakteriálneho kmeňa produkujúceho reaferón v 100 l fermentoroch s výťažnosťou 5-7x103 ME z 1 l kultivačnej tekutiny,

· zničenie biomasy metódou, ktorá umožňuje zvýšiť proces s 60-70% výťažnosťou cieľového produktu,

· predbežné čistenie reaferónu na iónomeniči; Konečné čistenie liečiva sa uskutočňuje na imunosorbente s monoklonálnymi protilátkami proti leukocytovému IFN-a typu 5AC.

Hlavnými producentmi rekombinantného IFN sú bakteriálne kmene, v cytoplazme ktorých sa IFN syntetizuje a tvorí len zlomok percenta celkovej hmotnosti bakteriálnych proteínov. Po nahromadení dostatočne vysokej koncentrácie buniek v špeciálnych fermentoroch sú tieto odstránené z fermentora a zničené (lyzované). Hlavné metódy lýzy sú: osmotický šok, zmrazenie-rozmrazenie, homogenizácia a ošetrenie detergentmi. Potom sa pomocou sekvenčných postupov filtrácie, centrifugácie, iónomeničovej chromatografie a gélovej chromatografie IFN predčistí, čo vedie k číremu bakteriálnemu extraktu, v ktorom IFN stále tvorí nie viac ako 1-2 % celkového proteínu. Konečné čistenie liečiva pomocou imunosorbentu s monoklonálnymi protilátkami proti IFN.

Monoklonálne protilátky proti IFN sa „naviažu“ na granuly nosiča a umiestnia sa do chromatografickej kolóny. Potom sa na kolónu aplikuje bakteriálny extrakt obsahujúci rekombinantný IFN. Iba IFN sa viaže na protilátky, zatiaľ čo ostatné zložky extraktu, vrátane všetkých bakteriálnych toxínov, voľne prechádzajú cez kolónu a sú odstránené premývacím roztokom. Na extrakciu rekombinantného IFN adsorbovaného na protilátky z kolóny sa cez ňu nechá prejsť roztok elučného pufra, ktorý má slabo kyslú reakciu. V tomto prípade je spojenie medzi molekulami IFN a protilátkami narušené. IFN prechádza z povrchu častíc Sepharose do tlmivého roztoku a môže sa zbierať ako čistá látka bez kontaminujúcich proteínov.

Rýchle rozšírenie používania rekombinantných IFN a paralelné zníženie V poslednej dobe Užívanie prírodných drog je spojené najmä s nedostatkom surovín na ich výrobu (darcovská krv), ako aj so šírením vírusových ochorení prenášaných krvou (HIV, hepatitída C). Preto, napriek prítomnosti niektorých výhod prírodných IFN liečiv, sa na klinike používajú takmer iba rekombinantné liečivá.

Rodina IFN-a obsahuje asi 20 podtypov, takže prírodné prípravky – Ľudský leukocytový interferón, Egiferon, Wellferon – sú viaczložkové a obsahujú všetky alebo aspoň väčšinu podtypov. Prirodzené IFN nemajú antigénne vlastnosti a nespôsobujú senzibilizáciu pri dlhodobom opakovanom podávaní. Naopak, niektoré rekombinantné IFN, keď sa podávajú injekciou, môžu spôsobiť tvorbu neutralizujúcich alebo väzbových protilátok.

Najčastejšie používané sú obyčajné (nePEGylované) a PEGylované alfa- a beta-IFN. Napríklad rekombinantný IFN-a2a (Reaferon, Roferon, Pegasis), rekombinantný IFN-a2b (Intron A, Realdiron, Peg-Intron), čo sú analógy prirodzených podtypov s bodovými mutáciami v proteínovej štruktúre lis-his, arg-his arg-arg, v tomto poradí, ktoré majú malý vplyv na aktivitu, ale sú významné z hľadiska senzibilizácie. IFN-a2a lieky, ktoré nie sú typické pre ľudskú populáciu, majú teda vysoké riziko spôsobenia senzibilizácie a tvorby protilátok, ktoré vo vysokých titroch znížia ich terapeutický potenciál.

Imunitný interferón (IFN gama) možno považovať za zložku liekov určených na liečbu vírusových, onkologických a autoimunitné ochorenia. V zahraničí bolo vytvorených množstvo liekov na jeho základe: Immuneron (USA), Immunomax (Japonsko), Imukin (Nemecko). V Rusku bola vyvinutá účinná schéma na získanie vysoko purifikovaného Deltaferonu, založená na dvoch po sebe nasledujúcich chromatografiách na rovnakom sorbente, ale pri rôznych hodnotách pH. Táto schéma umožňuje získať rekombinantný Deltaferon v preparatívnych množstvách s prijateľným obsahom vysokopolymérnych nečistôt. Zmeny v molekule proteínu (skrátenie molekuly o 10 aminokyselín a 3 substitúcie aminokyselín) viedli k 20-násobnej strate antivírusovej aktivity v porovnaní s IFN-γ plnej dĺžky, neovplyvnili však jeho imunomodulačné vlastnosti. V dôsledku tejto modifikácie sa deltaferon stal odolným voči proteolytické enzýmy. Boli vyvinuté experimentálne dávkové formy deltaferonu, ktoré umožňujú zachovanie proteínu v jeho natívnom stave bez straty špecifickej aktivity. Dávkové formy Deltaferonu majú imunomodulačné vlastnosti vlastné pôvodnému interferónu gama.

IFN preparáty treba z farmakologického hľadiska považovať predovšetkým za imunomodulátory ovplyvňujúce funkčnú aktivitu efektorových buniek imunitného systému a predovšetkým T-lymfocytov a monocytov (makrofágov). Pod vplyvom IFN sa zvyšuje účinnosť imunitného rozpoznávania antigénu a zosilňujú sa fagocytárne a cytolytické funkcie zamerané na elimináciu patogénu alebo buniek modifikovaných antigénom. Interferón cirkuluje v tele asi 2 týždne, čo je potrebné vziať do úvahy pri jeho použití ako profylaktického činidla.

Dlhoročné skúsenosti ukázali, že pri intranazálnom podaní má IFN výraznú preventívnu účinnosť proti rôznym vírusom chrípky a parainfluenzy. Ochranný účinok je najvýraznejší, keď sa liek používa denne pomocou inhalátorov alebo rozprašovačov. Opakované intranazálne aplikácie alebo inhalácia roztoku lieku cez nos a ústa vo forme aerosólu počas prvých dvoch dní choroby viedli k rýchlejšiemu poklesu príznakov intoxikácie a horúčkovej reakcie. Závažnosť zápalových javov v horných dýchacích cestách tiež klesala rýchlejšie. Nedávne štúdie ukázali, že IFN potláča proliferáciu nádorových buniek, čo ho robí účinným pri liečbe nádorových ochorení. Protinádorový účinok IFN možno vysvetliť stimuláciou prirodzenej obranné mechanizmy tela, najmä na lymfocytoch, ktoré zabíjajú rakovinové bunky alebo vytvárajú protilátky.

Doposiaľ bol identifikovaný rad chorôb, pri ktorých je použitie IFN účinné. Vírusové infekcie zahŕňajú ARVI, chrípku, encefalitídu, vírusovú hepatitídu, herpetické lézie očí (konjunktivitída, keratokonjunktivitída), sliznice a oči. Podľa lekárov by sa pri herpetických léziách kože a slizníc malo uprednostniť lokálne použitie lieku. IFN našiel použitie pri transplantáciách orgánov ako prostriedok na prevenciu sekundárnych vírusových infekcií. Stručná analýza nám umožňuje dospieť k záveru, že IFN je schopný pozitívne ovplyvniť vývoj širokého spektra ochorení vírusovej etiológie. Jeho účinnosť je najvýraznejšia pri akútnych infekciách, v počiatočných štádiách ochorenia. Pre klinické použitie by sa malo uprednostniť lokálne podávanie, ktoré zaisťuje minimálnu spotrebu lieku. Okrem toho lokálna aplikácia zabraňuje negatívnym účinkom pozorovaným pri systémovom podávaní vysokých dávok IFN.

Každá lieková forma má svoju vlastnú oblasť použitia, ktorá je určená jej imunobiologickými a farmakologické vlastnosti. Toto ustanovenie je formulované takto:

IFN prípravky by nemali spôsobovať senzibilizačné javy pri dlhodobom opakovanom užívaní v prerušovaných kúrach. Biosyntéza IFN na prípravu rôznych dávkových foriem sa môže uskutočňovať podľa jedinej technologickej schémy, ale spôsoby čistenia IFN a jeho kritériá musia spĺňať ciele terapie. V injekčných dávkových formách nesmú chýbať nečistoty, ktoré sú pre človeka antigénne. Ich hladina v prípravkoch na lokálne použitie by mala byť pod prahom senzibilizácie.

Teoreticky môžu prírodné prípravky IFN-a obsahovať 3 hlavné skupiny antigénov:

· antigény induktorového vírusu a kuracie alantoické tekutiny;

· antigény erytrocytov, ktoré určujú krvnú skupinu a stav Rh;

leukocytové antigény HLA.

Biotechnológia na výrobu IFN by mala zahŕňať operácie, ktoré obmedzujú možnosť prieniku týchto antigénov do liekových foriem. Technologicky najťažšou úlohou je odstránenie antigénov skupiny I, pretože v indukčnom štádiu sa do suspenzie zavádzajú vo veľkých množstvách.

Prípravky prírodného IFN-a možno v závislosti od metód čistenia rozdeliť do dvoch skupín – natívne a koncentrované. Proteínové prípravky natívneho typu sa prakticky nelíšia od pôvodných polotovarov, vyznačujú sa nízkou špecifickou aktivitou - do 1-104 IU na 1 mg proteínu, ale zachovávajú si všetky cytokíny produkované v procese interferonogenézy; v ich prirodzenom pomere. Preto majú vysoký potenciál imunobiologického účinku.

Biotechnológia na výrobu koncentrovaných liečiv zahŕňa chemické čistenie, ktoré vedie k zníženiu potenciálu imunobiologického účinku v dôsledku straty cytokínov. Tieto lieky sú však cenné aj pre praktické zdravotníctvo. Napríklad vysokokoncentrovaný ľudský leukocytový IFN - CLI na injekciu - je stále nevyhnutný v situáciách, keď je potrebné podávať vysoké jednotlivé dávky (lymfoblastická leukémia v akútnom štádiu), ako aj pri liečbe vírusových a onkologických lézií lokalizovaných za hematoencefalická bariéra. Medzi koncentrované lieky patrí aj interlock, ktorý sa úspešne používa na lokálna liečba vírusové očné infekcie.

Tretiu skupinu tvoria rekombinantné IFN, reprezentované reaferónom a realdonom. Pri mnohých formách patológie sú lokálne prípravky (intranazálne kvapky, masť, rektálne čapíky, očné filmy atď.) účinnejšie ako injekčné. Napríklad pri aktívnej chronickej HBV použite rektálne čapíky obsahujúci iba 100 000 IU IFN-a, poskytuje rovnaké výsledky ako intramuskulárne podanie vysoko koncentrovaného liečiva v dávke 3 IU. Spotreba lieku a náklady na liečbu pri použití rektálnych čapíkov sa desaťnásobne znižujú.

Moderné rekombinantné IFN prípravky:

Reaferon(ľudský rekombinantný IFN-a2) produkovaný NPO „Vector“, Novosibirsk.

· získaný kultiváciou bakteriálneho kmeňa Pseudomonas sporogenosa, ktorý obsahuje vo svojom genetickom aparáte integrovaný rekombinantný plazmid ľudského génu IFN-a2.

· určené na intramuskulárne, subkonjunktiválne a lokálne použitie.

Dostupné vo forme lyofilizovaného prášku v ampulkách.

Intron A(ľudský rekombinantný IFN-a2b) od Schering Plow - USA.

Liečivo bolo získané pomocou technológie rekombinantnej DNA s použitím bakteriálnej E. coli obsahujúcej geneticky upravený gén kódujúci tento ľudský proteín.

Špecifikácia aktivity 2*108 IU/mg proteínu.

Zavedenie veľkých dávok bielkovín je sprevádzané zvýšením teploty, bolesťami hlavy, gastrointestinálnymi ťažkosťami (nevoľnosť, niekedy exacerbácia hepatitídy) a poruchami vo fungovaní kardiovaskulárneho systému.

Na základe štúdia ontogenézy IFN systému bol vyvinutý nový domáci liek, viferon-čapíky, vrátane rekombinantného IFN-a a liekov s antioxidačným účinkom. Viferon sa pozitívne osvedčil pri liečbe vírusových a bakteriálnych ochorení u novorodencov: intrauterinný herpes, chlamýdie, ARVI, kandidóza

Pegylované interferóny

Antivírusová terapia je jednou z hlavných oblastí sľubného použitia PEGylovaných liečiv s peptidovou štruktúrou. Pozoruhodným príkladom využitia konceptu pegylácie biotechnologických liečiv je tvorba pegylovaných interferónov (peg-IFN). V klinickej praxi sa v súčasnosti používajú pegylované analógy interferónu alfa - PEG-interferón-alfa 2b (Pegintron; Shering Plough) a PEG-interferón-alfa 2a (Pegasys; Hoffmann La Roche).

V roku 1957 vedci zistili, že bunky infikované vírusom produkujú špeciálnu látku, ktorá inhibuje reprodukciu homológnych aj heterológnych vírusov, ktorú nazývali interferón. Ak imunitný systém zabezpečuje homeostázu proteínov a prostredníctvom nej eliminuje cudziu genetickú informáciu, potom interferónový systém priamo ovplyvňuje cudziu genetickú informáciu, vylučuje ju z tela na bunkovej úrovni a tým zabezpečuje homeostázu jadra. Interferónový systém úzko spolupracuje s imunitným systémom.
Interferóny sú kódované v genetickom aparáte bunky. Gény pre ľudský fibroblastový interferón sa nachádzajú v 2., 9. a dlhom ramene 5. chromozómu, činidlo regulujúce transkripciu sa nachádza v krátkom ramene toho istého chromozómu. Gén, ktorý určuje citlivosť na interferón, je lokalizovaný na 21. chromozóme. Gén pre α-interferón sa nachádza na 9. chromozóme a pre γ-interferón - na 11. chromozóme.
Interferónový systém nemá centrálny orgán, pretože všetky bunky tela stavovcov majú schopnosť produkovať interferón, hoci biele krvinky ho produkujú najaktívnejšie.
Interferón nie je spontánne produkovaný intaktnými bunkami a na jeho tvorbu sú potrebné induktory, ktorými môžu byť vírusy, bakteriálne toxíny, extrakty z baktérií húb, fytohemaglutiníny, syntetické látky - polykarboxyláty, polysulfáty, dextrány, ale najúčinnejšie induktory interferónu sú dvojité -vláknová RNA: dvojvláknová vírusová RNA dvojvláknové syntetické kopolyméry ribonukleotidov (poly-GC, poly-IC) atď. K indukcii interferónu dochádza v dôsledku derepresie jeho génov.
Druhy interferónov. Sú známe tri typy ľudských interferónov: a-interferón alebo leukocytový interferón, ktorý je produkovaný leukocytmi ošetrenými vírusmi a inými činidlami; β-interferón alebo fibroblastový interferón, ktorý je produkovaný fibroblastmi ošetrenými vírusmi a inými činidlami. Oba tieto interferóny patria do typu 1. Silnejší interferón γ, alebo imunitný interferón, patrí do typu 2. Existuje niekoľko podtypov α-interferónu a ich celkový počet u ľudí dosahuje 25. Porovnávacie charakteristiky ľudských interferónov sú uvedené v stôl. Aktivita interferónu sa meria v medzinárodných jednotkách (IU). Jedna jednotka zodpovedá množstvu interferónu, ktoré inhibuje reprodukciu vírusu o 50 %.
Počas indukcie interferónov sa syntetizujú dva z jeho typov. Pri indukcii interferónu na lymfoblastoch sa teda pri indukcii interferónu na fibroblastoch vytvorí 87 % leukocytov a 13 % fibroblastového interferónu. Medzi tromi typmi interferónov môžu existovať synergické interakcie.

tabuľka 2
Porovnávacie charakteristiky ľudských interferónov

Vlastnosti interferónov. Interferóny majú tkanivovú špecifickosť. To znamená, že ľudský interferón je aktívny len u ľudí, ale je neaktívny u iných druhov. Samozrejme, bariéry druhovej špecifickosti nie sú absolútne: ľudský interferón vykazuje určitú aktivitu v tkanivách veľké opice, kurací interferón v tele príbuzných druhov čeľade sliepok. Aktivita interferónu v heterogénnych organizmoch však prudko klesá.
Preto môžeme konštatovať, že interferóny, ktoré sa objavili u stavovcov, sa vyvíjali spoločne s ich hostiteľmi. Interferón je relatívne stabilný proteín, ktorý znáša kyslé prostredie (pH 2,2), čo sa používa na jeho izoláciu a čistenie. Antigénne vlastnosti interferónov sú slabo vyjadrené, a preto je možné protilátky proti nim získať až po opakovaných imunizáciách.
Interferóny nie sú špecifické pre vírusy a majú inhibičný účinok na reprodukciu rôznych vírusov, hoci rôzne vírusy majú nerovnakú citlivosť na interferón. Citlivosť na neme sa zvyčajne zhoduje s aktivitou indukujúcou interferón. Najčastejšie používané induktory interferónu, napríklad vírusy na jeho titráciu, sú rabdovírusy (vírus vezikulárna stomatitída), paramyxovírusy, togavírusy. Produkcia interferónu závisí aj od charakteru použitých buniek. Existujú bunky defektné v niekoľkých interferónových génoch.
Interferóny majú antivírusové, protinádorové, imunomodulačné a mnohé ďalšie účinky. Ich antivírusový účinok bol najviac študovaný a práve na vírusových modeloch sa podarilo objasniť biologické a iné vlastnosti interferónov.
Interferón má protinádorový účinok, keď sa podáva parenterálne vo veľkých dávkach, spojený s jeho potlačením cytoproliferatívnej aktivity. Pridanie interferónu do kultúry normálnych buniek je sprevádzané inhibíciou syntézy DNA do 2 hodín. V nádoroch vyvolaných vírusmi interferón inhibuje reprodukciu onkovírusov a súčasne potláča cytoproliferatívnu aktivitu.
Interferón je regulátor rôznych mechanizmov imunitnej odpovede, ktorý má stimulačný alebo inhibičný účinok na imunitné odpovede.
Mechanizmus účinku interferónu. Interferón sa viaže na bunkové receptory umiestnené na plazmatickej membráne, čo slúži ako signál na derepresiu zodpovedajúcich génov. V dôsledku toho sa indukuje syntéza špeciálnej proteínkinázy PKs, ktorá je prítomná v stopových množstvách vo všetkých cicavčích bunkách a je aktivovaná nízkymi koncentráciami dvojvláknovej RNA a v bunkách infikovaných vírusom komplexmi vírusovej replikácie.
Proteínkináza fosforyluje a podjednotku translačného iniciačného faktora eIF-2 a fosforylácia blokuje aktivitu iniciačného faktora. V dôsledku toho sa mRNA viazaná iniciačným komplexom nemôže viazať na veľkú ribozomálnu podjednotku, a preto je jej translácia blokovaná. Iniciačný faktor eIF-2 je rovnako potrebný na transláciu bunkových aj vírusových mRNA, ale translácia vírusových mRNA asociovaných s vírusovými dvojvláknovými RNA štruktúrami je prevažne blokovaná v dôsledku lokálnej aktivácie proteínkinázy.
V bunkách ošetrených interferónom sa indukuje syntéza enzýmu syntetázy, ktorá katalyzuje kyselinu 2,5-oligoadenylovú, ktorá prepína pôsobenie bunkových nukleáz na ničenie vírusových mRNA. Vírusové mRNA sú teda zničené nukleázami. Blokovanie štádia translácie interferónom a deštrukcia mRNA určujú jeho univerzálny mechanizmus účinku pri infekciách spôsobených vírusmi s rôznym genetickým materiálom.
Použitie interferónov. Interferóny sa používajú na prevenciu a liečbu množstva vírusových infekcií. Ich účinok je určený dávkou lieku, ale vysoké dávky interferónu majú toxický účinok. Interferóny sa široko používajú pri chrípke a iných akútnych respiračných ochoreniach. Liečivo je účinné v skorých štádiách ochorenia, aplikuje sa lokálne, napríklad instiláciou alebo podávaním pomocou inhalátora. Dýchacie cesty v koncentráciách do 3∙104-5∙104 jednotiek 2-3 krát denne. Pri konjunktivitíde sa interferón používa vo forme očných kvapiek. Interferóny majú terapeutický účinok na hepatitídu B, herpes, ako aj na zhubné novotvary. Pri týchto ochoreniach sa predpisujú vyššie koncentrácie. Liečivo sa používa parenterálne - intravenózne a intramuskulárne v dávke 105 jednotiek na 1 kg telesnej hmotnosti. Vyššie dávky majú vedľajšie účinky (horúčka, bolesť hlavy, vypadávanie vlasov, rozmazané videnie atď.). Interferón môže tiež spôsobiť lymfopéniu, oneskorené dozrievanie makrofágov, ťažký šok u detí a infarkt myokardu u pacientov s kardiovaskulárnymi ochoreniami. Purifikácia interferónu výrazne znižuje jeho toxicitu a umožňuje použitie vysokých koncentrácií. Purifikácia sa uskutočňuje pomocou afinitnej chromatografie s použitím monoklonálnych protilátok proti interferónu.
Geneticky upravený interferón. Geneticky upravený leukocytový interferón sa vyrába v prokaryotických systémoch (Escherichia coli). Biotechnológia na výrobu interferónu zahŕňa nasledujúce kroky:
1) ošetrenie leukocytovej hmoty induktormi interferónu;
2) izolácia zmesi mRNA z ošetrených buniek;
3) získanie celkovej komplementárnej DNA (cDNA) použitím reverznej transkriptázy;
4) inzercia cDNA do plazmidu Escherichia coli a jeho klonovanie;
5) výber klonov obsahujúcich interferónové gény;
6) zahrnutie silného promótora do plazmidu pre úspešnú génovú transkripciu;
7) expresia génu interferónu, t.j. syntéza zodpovedajúceho proteínu;
8) deštrukcia prokaryotických buniek a purifikácia interferónu pomocou afinitnej chromatografie.
Boli získané vysoko purifikované a koncentrované interferónové prípravky, ktoré sa testujú na klinike.
Ľudský leukocytový interferón, natívny a koncentrovaný, je určený na prevenciu a liečbu chrípky a iných vírusových respiračných ochorení.
Leukocytový interferón je druhovo špecifický proteín syntetizovaný ľudskými leukocytmi ako odpoveď na vplyv vírusu interferonogénu. Interferón nemá selektívnu antivírusovú aktivitu a pôsobí na takmer všetky vírusy.
Na prípravu interferónu sa používajú leukocyty z čerstvo získanej darcovskej krvi. Pod vplyvom vírusu interferonogénu syntetizujú leukocyty v kultivačnom médiu interferón. Leukocyty sa potom odstránia centrifugáciou a vírus sa inaktivuje. Liečivo je natívny interferón. Na získanie koncentrovaného natívneho interferónu sa ďalej čistí chromatografickou separáciou na Ssephadexových kolónach.
Interferón sa vyrába v suchej forme vo vampulách. Natívny suchý interferón je porézny sivohnedý prášok, ktorý sa ľahko rozpúšťa v destilovanej vode. Rozpustená droga má ružovočervenú farbu s kopalescenciou. Je povolený mierne hnedý odtieň roztoku. Koncentrovaný suchý prípravok je porézny sivobiely prášok, tiež ľahko rozpustný v destilovanej vode. Roztok liečiva má sivastú farbu s kopalescenciou, prijateľný je mierny žltkastohnedý odtieň. Nemali by tam byť žiadne cudzie látky.
Ľudský leukocytový interferón sa uvoľňuje virologicky a bakteriologicky sterilný. Antivírusová aktivita natívneho lieku musí byť najmenej 32 jednotiek, koncentrovaná - 100 jednotiek. Aktivita sa stanovuje titráciou vírusu vezikulárnej stomatitídy na primárnej kultúre buniek ľudského embryonálneho kožného svalového tkaniva.
Neexistujú žiadne kontraindikácie pre použitie lieku. Interferón je nereaktogénny a nespôsobuje vedľajšie účinky.
Liek sa uchováva pri teplote 4 °C. Čas použiteľnosti 1 rok. Po jej uplynutí možno vykonať opätovnú kontrolu v ústave, ktorý túto sériu lieku vyrobil. Pri zachovaní fyzikálnych vlastností a aktivity je možné trvanlivosť lieku predĺžiť o ďalšie 3 mesiace.

Interferóny sú proteínové molekuly s molekulovou hmotnosťou 15 000 až 21 000 daltonov produkované a vylučované bunkami ako odpoveď na vírusovú infekciu alebo iné patogény.

Interferóny (IFN) sú skupinou autogénnych glykoproteínov, ktorých biomechanizmus účinku je spojený so súčasným antivírusovým účinkom - aktiváciou bunkových génov, v dôsledku čoho sa syntetizujú proteíny, ktoré inhibujú syntézu vírusovej DNA (RNA) a majú imunomodulačný účinok - schopnosť zvýšiť expresiu antigénov na bunkových membránach a zvýšiť aktivitu cytotoxických T buniek a prirodzených zabíjačov.

IFN sa delia na dva typy. Prvý typ, ktorý pôsobí ako inhibítory vírusovej replikácie a má prevažne antivírusový účinok, zahŕňa 22 rôznych subtypov IFN-α a jeden subtyp IFN-β. Druhý typ, ktorý vykazuje imunomodulačnú aktivitu, zahŕňa IFN-y.

Existujú tri imunologicky odlišné triedy IFN: IFN-a, IFN-p, IFN-y.

Prirodzene sa vyskytujúce IFN zahŕňajú lymfoblastoidné a leukocytové IFN (IFN-a), syntetizované jednotlivo stimulovanými ľudskými monocytmi a B lymfocytmi, ktoré sú potom extrahované a purifikované; fibroblastový IFN (IFN-p), získaný z kultúry ľudských fibroblastov, a T-lymfocytový IFN (IFN-y).

Umelo syntetizované IFN zahŕňajú rekombinantný IFN-a, čo je vysoko purifikovaný jediný podtyp IFN-a produkovaný pomocou rekombinantnej molekulárnej technológie.

Sú známe spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov ľudskej darcovskej krvi, indukovaných vírusmi a inými induktormi.

Hlavnou nevýhodou týchto spôsobov výroby interferónov je pravdepodobnosť kontaminácie konečného produktu ľudskými vírusmi, ako je vírus hepatitídy B a C, vírus imunodeficiencie atď.

V súčasnosti sa za sľubnejší považuje spôsob výroby interferónu mikrobiologickou syntézou, ktorý umožňuje získať cieľový produkt s výrazne vyšším výťažkom z relatívne lacných východiskových materiálov. Tu použité prístupy umožňujú vytvárať varianty štruktúrneho génu, ktoré sú optimálne pre bakteriálnu expresiu, ako aj regulačné prvky, ktoré riadia jeho expresiu.

Ako zdrojové mikroorganizmy sa používajú rôzne konštrukcie kmeňov Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.

Nevýhodou použitia P. pastoris ako producenta interferónu sú extrémne náročné podmienky fermentácie tohto typu kvasiniek a potreba prísneho udržiavania koncentrácie induktora, najmä metanolu, počas procesu biosyntézy.

Nevýhodou používania Ps. putida je zložitosť fermentačného procesu pri nízkej úrovni expresie (10 mg interferónu na 1 liter kultivačného média). Produktívnejšie je použitie kmeňov Escherichia coli.

Je známy veľký počet plazmidov a kmeňov E. coli vytvorených na ich základe, ktoré exprimujú interferón: kmene E. coli ATCC 31633 a 31644 s plazmidmi Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 alebo Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN35-AHL6 (SU 1764515), E. coli kmeň pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli kmeň pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom p280/21FN.VKravchenko (VKrav. a iní Bioorganic chemistry, 1987, zv. 13, č. 9, str. 1186-1193), kmeň E. Coli SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), kmeň E. coli SG 20050 s plazmidom pINF16451. a pod. Nevýhodou technológií založených na použití týchto kmeňov je ich nestabilita, ako aj nedostatočná úroveň expresie interferónu.

Spolu s charakteristikami použitých kmeňov účinnosť procesu do značnej miery závisí od technológie použitej na izoláciu a čistenie interferónu.

Je známy spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa kultiváciu Ps buniek. putida, deštrukcia biomasy, úprava polyetylénimínom, frakcionácia síranom amónnym, hydrofóbna chromatografia na fenylsilochróme C-80, pH frakcionácia lyzátu, jeho zahusťovanie a diafiltrácia, ionexová chromatografia na celulóze DE-52, elúcia v pH gradiente, ión výmenná chromatografia výsledného eluentu na celulóze SM-52, zahustenie prechodom cez filtračnú kazetu a gélová filtrácia na Sephadexe G-100 (SU 1640996). Nevýhodou tohto spôsobu je popri zložitej viacstupňovej fermentácii viacstupňový proces pri získavaní finálneho produktu.

Je tiež známy spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa kultiváciu kmeňa E. coli SG 20050/pIF16 v LB bujóne vo fľašiach v trepačke s termostatom, odstredenie biomasy, jej premytie tlmivým roztokom a ošetrenie ultrazvukom na zničenie buniek. Výsledný lyzát sa odstredí, premyje 3M roztokom močoviny v tlmivom roztoku, rozpustí v roztoku guanidínchloridu v tlmivom roztoku, spracuje ultrazvukom, centrifuguje, oxidačnou sulfitolýzou, dialýzou proti 8 M močovine, renaturáciou a záverečnou dvojstupňovou chromatografiou na CM- 52 celulóza a Sephadex G-50 (RU 2054041).

Nevýhodou tejto metódy je jej relatívne nízka produktivita hlavných etáp procesu izolácie a čistenia. To platí najmä pre úpravu produktu ultrazvukom, dialýzu a oxidačnú sulfitolýzu, čo vedie k nestabilite výťažku interferónu, ako aj nemožnosti použiť túto metódu na priemyselnú výrobu interferónu.

Ako najbližší analóg (prototyp) možno uviesť spôsob výroby ľudského leukocytového interferónu, ktorý spočíva v kultivácii rekombinantného kmeňa E. coli, zmrazení výslednej biomasy pri teplote neprevyšujúcej -70 °C, rozmrazení, zničení buniek mikroorganizmov s lyzozýmom, odstránenie DNA a RNA zavedením do lyzátu DNAzy a purifikácia izolovanej nerozpustnej formy interferónu premytím tlmivým roztokom s detergentmi, rozpustenie zrazeniny interferónu v roztoku hydrochloridu guanidínu, renaturácia a jednostupňové čistenie iónom výmenná chromatografia. Ako producent sa použije kmeň E. coli SS5 získaný použitím rekombinantného plazmidu pSS5 obsahujúceho tri promótory: Plac, Pt7 a Ptrp a gén alfa-interferónu so zavedenými nukleotidovými substitúciami.

Expresia interferónu kmeňom E. coli SS5 obsahujúcim tento plazmid je riadená tromi promótormi: Plac, Pt7 a Ptrp. Úroveň expresie interferónu je asi 800 mg na 1 liter bunkovej suspenzie.

Nevýhodou tejto metódy je nízka technologická účinnosť využitia enzymatickej deštrukcie buniek, DNA a RNA mikroorganizmu a jednostupňová chromatografická purifikácia interferónu. To spôsobuje nestabilitu v procese uvoľňovania interferónu, vedie k zníženiu jeho kvality a obmedzuje možnosť použitia vyššie uvedenej schémy na priemyselnú výrobu interferónu.

Nevýhodou tohto plazmidu a kmeňa na ňom založeného je použitie v plazmide silného neregulovaného promótora fága T7 v E. coli kmeň BL21 (DE3), v ktorom je gén T7 RNA polymerázy umiestnený pod promótorom tzv. lac operón a ktorý vždy „tečie“. V dôsledku toho v bunke nepretržite prebieha syntéza interferónu, čo vedie k disociácii plazmidu a zníženiu životaschopnosti buniek kmeňa a v dôsledku toho k zníženiu výťažku interferónu.

Na získanie veľkých množstiev IFN sa používajú šesťdňové jednovrstvové kultúry buniek kuracích embryí alebo kultivovaných ľudských krvných leukocytov infikovaných určitým typom vírusu. Inými slovami, na získanie IFN sa vytvorí určitý systém vírus-bunka.

Gén zodpovedný za biosyntézu IFN bol izolovaný z ľudskej bunky. Exogénny ľudský IFN sa vyrába pomocou technológie rekombinantnej DNA. Postup izolácie IFN-s cDNA je nasledujúci:

1) mRNA je izolovaná z ľudských leukocytov, frakcionovaná podľa veľkosti, reverzne transkribovaná a vložená do miesta modifikovaného plazmidu.

2) Výsledný produkt sa použije na transformáciu E. coli; výsledné klony sú rozdelené do skupín, ktoré sú identifikované.

3) Každá skupina klonov sa hybridizuje s IFN - mRNA.

4) Z výsledných hybridov obsahujúcich cDNA a chRNA sa izoluje mRNA a preloží sa v systéme syntézy proteínov.

5) Stanovte antivírusovú aktivitu interferónu každej zmesi získanej ako výsledok translácie. Skupiny, ktoré vykazovali aktivitu interferónu, obsahujú klon s cDNA hybridizovaný s IFN-mRNA; znovu sa identifikuje klon obsahujúci humánnu IFN cDNA plnej dĺžky.

2. Mechanizmy účinku interferónov

IFN vykazujú určité aktivity ako lymfokíny a imunomodulátory. IFN typu I, ktoré pôsobia primárne ako inhibítory vírusovej replikácie v bunke, uplatňujú svoj účinok stimuláciou produkcie bunkových enzýmov ribozómami hostiteľských buniek, ktoré inhibujú produkciu vírusov, narúšajú transláciu vírusovej mRNA a syntézu vírusové proteíny.

IFN produkuje väčšina živočíšnych druhov, ale prejav ich aktivity je druhovo špecifický, t.j. účinkujú len v druhu zvierat, v ktorom sa vyrábajú.

IFN spôsobujú indukciu troch enzýmov:

proteínkináza, ktorá narúša počiatočnú fázu výstavby peptidového reťazca;

oligoizoadenylátsyntetáza, ktorá aktivuje RNázu, ktorá ničí vírusovú RNA;

fosfodiesteráza, ktorá ničí konečné nukleotidy tRNA, čo vedie k narušeniu predlžovania peptidov.

Berúc do úvahy antivírusové a imunomodulačné účinky IFN, NPO Biomed navrhla a úspešne otestovala čapíky s IFNan1 a probiotikami na liečbu dysbakteriózy vírusovej a bakteriálnej etiológie, kandidózy; v gynekologickej praxi na liečbu endometritídy, kolpitídy, vaginitídy a gynekologického herpesu.

3. Terapeutické využitie ľudského INF

Existujú dve generácie interferónových liekov. Prvá generácia sa vyznačuje prírodným pôvodom, pri ktorom sa získava z krvi darcov. Získava sa z nej suchý ľudský leukocytový interferón, ktorý sa používa na inhaláciu a instiláciu do nosových priechodov. Tiež produkujú interferón v čapíkoch, purifikovaný koncentrovaný interferón v suchej forme a Leukinferon.

Tento spôsob výroby liekov na báze interferónu je dosť drahý a nedostupný, takže koncom 20. storočia boli pomocou genetického inžinierstva vytvorené interferónové lieky druhej generácie.

Tak bolo možné vyvinúť lieky Viferon, Interal a ďalšie obsahujúce rekombinantný ľudský interferón alfa

Kvôli ich jedinečné vlastnosti Interferónové prípravky sa používajú pri liečbe a prevencii všetkých ochorení dýchacích ciest, väčšiny nádorových ochorení, pri liečbe mnohých vírusových ochorení a chrípky. Prípravky s interferónom sa široko používajú pri liečbe hepatitídy B a C: interferón obmedzuje vývoj vírusu, zabraňuje výskytu cirhózy a eliminuje smrť.

Niektoré interferónové lieky majú vedľajšie účinky, ako sú kožné vyrážky, alergie a ochorenia hematopoetického systému.

Pri dlhodobom užívaní interferónu si telo vytvára protilátky proti interferónu, vďaka čomu nie je schopné bojovať s vírusmi. Príčina týchto javov spočíva v prítomnosti albumínu v prípravkoch na báze interferónu.

Albumín sa získava z krvi, takže existuje riziko (aj keď minimálne) nákazy hepatitídou a inými krvou prenosnými chorobami.

Názov lieku	Podtyp INF	Spôsob získania	farmakologický účinok	Indikácie na použitie
Interferón		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom vírusov	Antivírusové, imunomodulačné, antiproliferatívne	Vírusové ochorenia, leukémia, malígny melanóm, rakovina obličiek, karcinoidný syndróm
Blokovanie		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom paramykovírusov	Potláča aktivitu množstva vírusov	Vírusové ochorenia očí, hepatitída	Rekombinantný	Antivírusový, imunomodulačný, inhibuje proliferáciu širokého spektra nádorových buniek	Epiteliálna forma akútnej a rekurentnej vírusovej infekcie oka; onkologické ochorenia
Interferón alfa-2a		Rekombinantný. Proteín obsahujúci 165 aminokyselín	Antivírusová, protinádorová aktivita	Leukemická retikuloendotelióza, Kaposiho sarkóm, rakovina obličiek, močového mechúra, melanóm, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantný INF produkovaný bakteriálnym kmeňom pseudomonas, ktorého genetický aparát obsahuje ľudský leukocytový gén IFN α2. Identický s ľudským leukocytovým IFN a2.		Vírusové, nádorové ochorenia
Interferón alfa – n1		Vysoko purifikovaný ľudský INF	Antivírusový	Chronická aktívna infekčná hepatitída B
Inreferon beta		Superprodukcia ľudských fibroblastov stimulátorom v prítomnosti metabolických inhibítorov	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické vírusové infekcie v oftalmológii, gynekológii a urológii, dermatológii, hepatológii, onkológii
Interferón gama		Rekombinantný	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické granulomatózne ochorenia

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Dočasný liekopisný článok 42U-23/60-439-97. Ľudský rekombinantný interferón alfa-2.

5. Gavrikov A.V. Optimalizácia biotechnologickej produkcie rekombinantných ľudských interferónových látok - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.

7. Štátny liekopis ZSSR. Vyd. XI., číslo 1.- S. 175.

8. Štátny register liekov / Ed. A.V. Katlinsky a ďalší - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Molekulárna biotechnológia interferónov. // zborník vedeckej a praktickej konferencie „Interferón – 50 rokov“. – M., 2007, s. 17-23

10. Základy farmaceutickej biotechnológie: Návod/ T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Michaleva. – Rostov na Done: Phoenix; Tomsk: Vydavateľstvo NTL, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. a iné Účinnosť rekombinantného alfa-dva-interferónu v vírusová hepatitída In//Medical business.- Kyjev, 1990.- Číslo 9.- S. 105–108.

Odoslanie dobrej práce do databázy znalostí je jednoduché. Použite nižšie uvedený formulár

Študenti, postgraduálni študenti, mladí vedci, ktorí pri štúdiu a práci využívajú vedomostnú základňu, vám budú veľmi vďační.

Uverejnené na http://www.allbest.ru/

Úvod

1 Klasifikácia interferónov

2 Spôsoby získavania interferónov

2.1 Produkcia ľudských leukocytov infekciou

2.2 Získavanie interferónov genetickým inžinierstvom

3. Mechanizmy účinku interferónov

4. Terapeutické použitie ľudského interferónu

Záver

Zoznam použitej literatúry

Úvod

V roku 1957 Národný inštitút pre lekársky výskum v Londýne zistil, že ľudské a zvieracie bunky vystavené vírusu vylučujú látky, vďaka ktorým sú neovplyvnené bunky odolné voči vírusovej infekcii. Zdá sa, že zabraňujú (zasahujú) do reprodukcie vírusov v bunke, a preto sa nazývali interferóny. Interferóny pomáhajú nášmu telu bojovať proti mnohým vírusovým ochoreniam.

Prípravky na báze rôzne druhy interferóny sa používajú ako imunomodulátory na normalizáciu a posilnenie imunitného systému, vrátane liečby rôznych závažných ochorení - akútnej vírusovej hepatitídy, roztrúsenej sklerózy, osteosarkómu, myelómu a niektorých typov lymfómov.

Interferóny sú proteínové molekuly s molekulovou hmotnosťou 15 000 až 21 000 daltonov produkované a vylučované bunkami ako odpoveď na vírusovú infekciu alebo iné patogény.

1. TOklasifikácia interferónov

V závislosti od typu produkujúcich buniek možno všetky interferóny rozdeliť na:

b-interferóny.

* β-interferóny.

* interferóny g.

Podľa spôsobu výroby sa interferóny delia na:

1. Prírodné, získané z kultúry ľudských leukocytových buniek stimulovaných vírusmi:

b-interferón, b-interferón, interferón-b Nl;

2. Rekombinant, produkovaný baktériami s integrovaným interferónovým génom v ich genóme:

Interferón-b2A, interferón-b2B, interferón-blb.

Interferón - b je produkovaný leukocytmi a nazýva sa leukocyty; β-interferón sa nazýva fibroblastický, pretože ho syntetizujú fibroblasty - bunky spojivového tkaniva, a interferón g sa nazýva imunitný, pretože ho produkujú aktivované T-lymfocyty, makrofágy, prirodzené zabíjačské bunky, t.j. imunitné bunky.

Pod vplyvom interferónu-g sa zvyšuje produkcia cytokínov, ako je interleukín-1, interleukín-2, interleukín-12, IFNb a tumor nekrotizujúci faktor-b.

2. Spôsoby získavania interferónov

Interferóny sa získavajú dvoma spôsobmi:

a) infekciou ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom, v dôsledku čoho infikované bunky syntetizujú interferón, ktorý sa potom izoluje a z neho sa skonštruujú interferónové prípravky;

b) genetickým inžinierstvom - pestovaním rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón za produkčných podmienok.

2 . 1 Pzískanie podľainfekcia ľudských leukocytov

Sú známe spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov ľudskej darcovskej krvi, indukovaných vírusmi a inými induktormi.

Ľudské krvné leukocyty sú hlavnými producentmi prirodzeného interferónu-alfa, ktorého množstvo je na účely výroby obmedzené darcovskými surovinami. V tejto súvislosti sa riešia otázky optimalizácie metód kultivácie leukocytov s cieľom zvýšiť výťažok cieľového produktu a vyvinúť jednotný efektívna metóda získanie prirodzeného IFN pre tvorbu nových liekových foriem sa dnes javí ako veľmi dôležité a relevantné pre praktickú zdravotnú starostlivosť.

Známa je technológia výroby ľudského leukocytového interferónu, ktorá zahŕňa nasledujúcu postupnosť operácií: izoláciu leukocytov z darcovskej krvi, leukocytovej alebo erytrocytovej hmoty, ich suspendovanie v živnom médiu pri teplote (37±0,5) o C, pridanie induktor alantoického vírusu do leukocytov a inkubácia pri (30 ± 0,5) °C počas 3 hodín. Potom sa induktor vírus oddelí a k sedimentu leukocytov sa pridá živné médium a suspenzia sa udržiava pri teplote (37 ±). 0,5) o C počas 18-20 hodín V tomto štádiu prebieha biosyntéza interferónu v leukocytoch a jeho akumulácia v živnom médiu získanom touto technológiou má antivírusovú aktivitu 800-1000 IU na 1 ml liečiva.

Aby sa zvýšila produkcia interferónu leukocytmi v štádiu biosyntézy, v inom predpise na produkciu ľudského leukocytového interferónu N 302-82 sa suspenzia leukocytov udržiava pri teplote 37,5 °C počas 2-10 hodín v živnom médiu obsahujúcom 100-200 jednotiek/ml ľudského leukocytového interferónu a 0,0015 jednotiek/ml inzulínového induktora v štádiu indukcie interferónu; Potom sa induktor vírus odstráni a k sedimentu leukocytov sa pridá živné médium a suspenzia sa udržiava pri teplote 37,5 °C počas 18 až 20 hodín v štádiu biosyntézy interferónu a supernatant obsahujúci interferón sa inaktivuje.

Zavedenie primárneho štádia výrazne zvyšuje produkciu interferónu leukocytmi a antivírusová aktivita interferónu získaná touto metódou je 4000-5000 IU/ml. Je potrebné poznamenať, že vo všetkých vyššie uvedených výrobných technológiách a iných známych metódach získavania ľudského leukocytového interferónu sa leukocyty izolujú z krvi, ktorá sa skladuje pri teplote 4-6 o C, a samotný proces izolácie prebieha pri rovnakej teplote. s následným ich zavedením do živného média pri teplote 37,5 °C a vykonaním fázy aktivácie, indukčnej fázy a biosyntézy interferónu.

Nasledujúci spôsob výroby interferónu je vybraný ako prototyp, pretože je technicky najbližší. Účelom metódy je zvýšiť výťažok cieľového produktu. Na tento účel bol navrhnutý spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa izoláciu leukocytov, ich suspendovanie v živnom médiu a aktiváciu za podmienok postupného zvyšovania teploty suspenzie z 20 °C na (36,6 ± 0,1) °C počas 4-6 °C. hodiny, indukcia alantoickým vírusom Newcastleská choroba, biosyntéza interferónu a inaktivácia induktora vírusu. Porovnávacia analýza základných znakov metód ukazuje, že charakteristickými znakmi navrhovanej metódy je aktivácia leukocytov s pomalým nárastom teploty suspenzie z 20 °C na (36,6 ± 0,1) °C počas 4-6 hodín. Navrhovaný teplotný režim primovania leukocytov zabezpečuje podmienky pre intenzívnu biosyntézu INF. Spôsob sa uskutočňuje nasledovne. Izolované leukocyty z darcovskej krvi, leukocytov alebo erytrocytov sa suspendujú v 5 litroch živného média (médium 199) obsahujúceho 0,0015 jednotiek/ml inzulínu a 1500 – 3000 IU/ml ľudského leukocytového interferónu 5 – 10 % ľudskej krvnej plazmy alebo 1,5 – 2 % ľudský albumín a antibiotiká. 1 ml živného média obsahuje 10020 miliónov leukocytov. Živné médium obsahujúce vyššie uvedené východiskové zložky má počiatočnú teplotu 20 o C. V automatizovanom režime sa podľa programu teplota suspenzie zvýši z 20 o C na (36,6 ± 0,1) o C počas 4-6 hodín Potom sa teplota suspenzie upraví na (36,9 ± 0,1) o C a do suspenzie sa pridá induktorový vírus v dávke 2 000-4 000 GAE na 2 miliardy leukocytov, suspenzia sa inkubuje pri (36,9 ± 0,1) o C. 18-20 hodín za stáleho miešania. Leukocyty sa odstránia centrifugáciou a supernatant v množstve 4,5 l obsahujúci interferón sa okyslí 10 % kyselina chlorovodíková na pH 2,2-2,4. Okyslený polotovar interferónu sa uchováva 10 dní, aby sa inaktivoval induktor vírusu. Antivírusová aktivita interferónu získaného týmto spôsobom je 10-12 tisíc IU / ml.

Navrhovaný spôsob získania ľudského leukocytového interferónu teda zaisťuje zvýšenie jeho antivírusovej aktivity 2 alebo viackrát v porovnaní s predchádzajúcou metódou. Použitie navrhovanej metódy vo výrobe pomôže ušetriť náklady na materiál, pretože je zameraná na viac efektívne využitie leukocytov, a nie zvýšiť ich počet.

Hlavnou nevýhodou týchto spôsobov výroby interferónov je pravdepodobnosť kontaminácie konečného produktu ľudskými vírusmi, ako je vírus hepatitídy B a C, vírus imunodeficiencie atď.

2.2 Získanie interferónovgeneticky modifikované

vírus interferónového leukocytového génu

Ako zdrojové mikroorganizmy sa používajú rôzne konštrukcie kmeňov Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.

Je známy veľký počet plazmidov a kmeňov E. coli vytvorených na ich základe, ktoré exprimujú interferón: kmene E. coli ATCC 31633 a 31644 s plazmidmi Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 alebo Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN35-AHL6 (SU 1764515), E. coli kmeň pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli kmeň pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom p280/21FN, E. Coli kmeň SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom pINF16 (RU 2054041) atď. Nevýhodou technológií založených na použití týchto kmeňov je ich nestabilita, ako aj nedostatočná úroveň expresia interferónu.

Spolu s charakteristikami použitých kmeňov účinnosť procesu do značnej miery závisí od technológie použitej na izoláciu a čistenie interferónu.

Expresia interferónu kmeňom E. coli SS5 obsahujúcim tento plazmid je riadená tromi promótormi: Plac, Pt7 a Ptrp. Úroveň expresie interferónu je asi 800 mg na 1 liter bunkovej suspenzie.

Príklad získania rekombinantného interferónu:

600 g biomasy buniek Pseudomonas putida 84 obsahujúcej rekombinantný plazmid pVG-3 po kultivácii obsahovalo 130 mg alfa-2 interferónu. Bunky sa vložili do 5,0 1 balistického dezintegrátora s mechanickým miešadlom a 3,0 1 lyzačného pufra obsahujúceho 1,2 % chloridu sodného, 1,2 % tris-(hydroxymetyl)-aminometánu, 10 % sacharózy, 0,15 % kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA), 0,02 % fenylmetylsulfonylfluoridu a 0,01 % ditiotreitolu pri pH 7,7. Biomasa sa miešala, kým sa nezískala homogénna suspenzia počas 30 minút, potom sa dezintegrovala v cirkulačnom režime v balistickom dezintegrátore podľa návodu na obsluhu. Doba dezintegrácie bola 1,5 hodiny. Proces dezintegrácie bol ukončený, keď pri mikroskopovaní preparátu v niekoľkých zorných poliach mikroskopu neboli pozorované prakticky žiadne celé bunky mikroorganizmov. Objem lyzovanej suspenzie biomasy bol 3,5 l.

Lyzát získaný v tomto štádiu potom vstúpil do štádia zrážania nukleovej kyseliny. Na tento účel sa do nádoby obsahujúcej lyzát pridalo 180 ml 5 % roztoku polyetylénimínu za miešania rýchlosťou 1 až 1,2 l/h. Suspenzia sa miešala 1 hodinu a centrifugovala, aby sa oddelil sediment nukleovej kyseliny 1 hodinu pri (9500 ± 500) ot./min., pri teplote (5 ± 2)C. Po odstredení sa oddelil supernatant, ktorého objem bol 3,0 l.

Za pomalého miešania miešadlom sa do supernatantu po malých častiach nalialo 182 g suchého síranu amónneho (každá ďalšia dávka sa pridala po úplnom rozpustení predchádzajúcej). Po dokončení pridávania síranu amónneho sa v miešaní pokračovalo, kým sa soľ úplne nerozpustila a suspenzia proteínového sedimentu sa udržiavala pri teplote (5 ± 2) C počas 16 hodín a potom sa centrifugovala počas 1 hodiny pri (13 500 ± 500) ot./min pri teplote (5 ± 2) S.

Výsledná zrazenina sa rozpustila v destilovanej vode, čím sa celkový objem upravil na 4 litre. Na vyzrážanie sprievodných proteínov sa uskutočnila kyslá frakcionácia výsledného roztoku obsahujúceho alfa-2 interferón. Na tento účel sa k roztoku pridalo 5,0 ml 50 % kyseliny octovej do pH 4,75. Výsledná zmes bola prenesená do chladničky a ponechaná pri teplote (5±2)C počas 3 hodín, potom bola proteínová suspenzia centrifugovaná pri (13500±500) otáčkach za minútu počas 30 minút pri (5±2)C.

Do 4 1 supernatantu sa pridalo 50,0 ml 1 M roztoku Tris do pH (6,9 ± 0,1). Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou bola 9,0 mg/ml, biologická aktivita alfa-2 interferónu (6,80,5) 106 IU/ml. Špecifická aktivita 8,5105 IU/mg. Celkový obsah interferónu alfa-2 v tomto štádiu je 2,91010 IU.

Sorbent Soloz KG v množstve 0,6 l vo forme vodnej suspenzie bol umiestnený do chromatografickej kolóny. Potom pomocou peristaltického čerpadla 2,0 l 0,2 M roztoku hydroxidu sodného, 6,0 l destilovanej vody a 4,5 l 0,05 M tris-acetátového tlmivého roztoku pri pH (7,1±0,1), ktoré bolo monitorované pH metrom pri výstup z kolóny.

Proteínový roztok obsahujúci alfa-2 interferón sa zriedil destilovanou vodou na vodivosť (6,0 + 2,0) mS/cm pri teplote miestnosti. Objem roztoku bol 19,2 litra.

Roztok sa nanášal na kolónu rýchlosťou 1,5 l/hod., potom sa sorbent premyl 2,0 1 Tris-acetátového tlmivého roztoku 0,05 M pri pH 7,0. Elúcia sa uskutočnila s 1,2 1 0,05 M Tris roztoku s pH (10,2 ± 0,1).

Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou je (2,2 ± 0,2) mg/ml, biologická aktivita interferónu alfa-2 (2,1 ± 0,5) 107 IU/ml, špecifická aktivita liečiva (9,7 ± 0,5). )106 IU/mg. Celkový obsah interferónu alfa-2 v tomto štádiu je (1,5±0,5)1010 IU.

Sorbent Spherocell qae v množstve 0,15 l vo forme vodnej suspenzie bol naplnený do kolóny a premývaný rýchlosťou 0,15 l/h postupne 0,5 l 2 M roztoku chloridu sodného, 1,5 l destilovanej vody a 1,0 l. 1 trisacetátového tlmivého roztoku 0,05 M s pH 8,0, sledovanie pH tlmivého roztoku na výstupe z kolóny pomocou pH metra.

0,7 1 proteínový roztok obsahujúci alfa-2 interferón sa aplikoval na 0,15 1 sorbentový stĺpec Spherocell-QAE rýchlosťou 0,2 l/hodinu. Kolóna sa premyla 0,1 1 Tris-acetátového 0,05 M tlmivého roztoku (pH 8,0), potom sa proteíny nečistôt premyli 1,0 1 rovnakého tlmivého roztoku s prídavkom 0,05 M NaCl. Interferón sa eluoval 0,8 1 0,1 M tlmivého roztoku octanu sodného pri pH 5,0. Obsah alfa-2 interferónu vo frakciách zozbieraných pomocou zberača bol stanovený metódou enzýmového imunotestu. Koncentrácia proteínu bola (0,35±0,05) mg/ml, biologická aktivita interferónu alfa-2 bola (1,7±0,2)107 IU/ml. Špecifická aktivita liečiva je 5,5107 IU/mg proteínu. Eluát obsahoval 1,20 x 1010 ME. Výťažok biologickej aktivity v tomto štádiu je 82,5 %.

Výsledný roztok sa upravil na pH (5,0 ± 0,1) 50 % octová kyselina a zriedi sa 0,05 M tlmivým roztokom octanu sodného. Špecifická elektrická vodivosť bola (0,29±0,02) mS/cm pri teplote (5±2)C. Takto pripravený proteínový roztok bol nanesený na kolónu so sorbentom Spherocell LP-M rýchlosťou 0,1 l/h, premytý 0,3 l vyššie uvedeného tlmivého roztoku a potom bol interferón eluovaný lineárnym gradientom koncentrácie chloridu sodného. vytvorený použitím Ultragrad gradientového mixéra Eluát sa frakcionoval použitím zberača frakcií a merala sa koncentrácia celkového proteínu a alfa-2 interferónu. Koncentrácia proteínu v spojených frakciách (0,45 ± 0,02) mg/ml. Objem roztoku je 0,1 l. Celkový obsah interferónu alfa-2 (8,6±0,2)109 IU. Špecifická aktivita - e (7,5±0,2)107 IU/mg. Výťažok v tomto štádiu je 73 %.

Výsledný 0,1 1 roztok 3 sa skoncentroval na (5,0 ± 0,2) ml použitím ultrafiltračnej cely s použitím membrány Amicon YM-3. Takto pripravená vzorka bola nanesená na kolónu so sorbentom Sephadex G-100, ekvilibrovanú fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom pri rýchlosti 0,025 l/h. Objem frakcií je 10,0 ml. Frakcie získané po chromatografii sa testovali na obsah alfa-2 interferónu použitím metódy enzýmového imunotestu a kombinovaním frakcií obsahujúcich hlavný vrchol alfa-2 interferónu. Objem výsledného roztoku bol 30,2 ml. Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou je (0,90 ± 0,02) mg/ml. Celkový obsah alfa-2 interferónu v roztoku je 5,5109 ME. Špecifická aktivita výsledného prípravku alfa-2 interferónu je 2,3108 IU/mg. Výťažok alfa-2 interferónu v tomto štádiu je 90,2 %. Výsledný produkt bol sterilizovaný a zabalený. Celkový výťažok liečiva je 35,8 %, vrátane 51 % v štádiu čistenia.

Gén zodpovedný za biosyntézu IFN bol izolovaný z ľudskej bunky. Exogénny ľudský IFN sa vyrába pomocou technológie rekombinantnej DNA. Postup izolácie IFN-s cDNA je nasledujúci:

1) mRNA je izolovaná z ľudských leukocytov, frakcionovaná podľa veľkosti, reverzne transkribovaná a vložená do miesta modifikovaného plazmidu.

2) Výsledný produkt sa použije na transformáciu E. coli; výsledné klony sú rozdelené do skupín, ktoré sú identifikované.

3) Každá skupina klonov sa hybridizuje s IFN - mRNA.

4) Z výsledných hybridov obsahujúcich cDNA a chRNA sa izoluje mRNA a preloží sa v systéme syntézy proteínov.

5) Stanovte antivírusovú aktivitu interferónu každej zmesi získanej ako výsledok translácie. Skupiny, ktoré vykazovali aktivitu interferónu, obsahujú klon s cDNA hybridizovaný s IFN-mRNA; klon obsahujúci humánnu IFN cDNA plnej dĺžky sa znovu identifikuje.

3 . Mechanizmy účinku interferónov

Interferóny vykazujú niektoré aktivity ako lymfokíny a imunomodulátory. IFN typu I, ktoré pôsobia primárne ako inhibítory vírusovej replikácie v bunke, uplatňujú svoj účinok stimuláciou produkcie bunkových enzýmov ribozómami hostiteľských buniek, ktoré inhibujú produkciu vírusov, narúšajú transláciu vírusovej mRNA a syntézu vírusové proteíny.

Interferóny produkuje väčšina živočíšnych druhov, ale prejav ich aktivity je druhovo špecifický, t.j. účinkujú len v druhu zvierat, v ktorom sa vyrábajú.

Interferónyspôsobujú indukciu troch enzýmov:

Proteínkináza, ktorá narúša počiatočnú fázu výstavby peptidového reťazca;

Oligoizoadenylátsyntetáza, ktorá aktivuje RNázu, ktorá ničí vírusovú RNA;

Fosfodiesteráza, ktorá ničí konečné nukleotidy tRNA, čo vedie k narušeniu predlžovania peptidov.

Berúc do úvahy antivírusové a imunomodulačné účinky interferónu, NPO "Biomed" navrhol a úspešne otestoval čapíky s IFNan1 a probiotikami na liečbu dysbiózy vírusovej a bakteriálnej etiológie, kandidózy; v gynekologickej praxi na liečbu endometritídy, kolpitídy, vaginitídy a gynekologického herpesu.

4. Terapeutické použitie interferónuosoba

Interferóny (INF) majú univerzálne široké spektrum antivírusovej aktivity, keďže nepôsobia na virióny ani ich NK, ale vyvolávajú v bunke antivírusový stav, stimulujúc tvorbu komplexu proteínov, ktoré blokujú transkripciu vírusovej mRNA. INF neprenikajú do buniek, ale interagujú s membránovými receptormi, čím vyvolávajú tvorbu cAMP, ktorý prenáša signál na zodpovedajúci DNA operón. Okrem toho INF aktivujú gény kódujúce produkty s priamym antivírusovým účinkom – proteínkinázy, ktoré narúšajú zostavenie molekuly proteínu, a adenylátsyntetázy, ktorých produkt aktivuje endonukleázu, ktorá ničí vírusové mRNA. Gamma-INF aktivuje cytotoxické lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky, monocyty, makrofágy, granulocyty, ktoré prispievajú k deštrukcii infikovaných buniek.

Tak bolo možné vyvinúť lieky Viferon, Interal a ďalšie obsahujúce rekombinantný ľudský interferón-b.

Pre svoje jedinečné vlastnosti sa používajú interferónové prípravky liečbe a prevencia všetkých ochorení dýchacích ciest, väčšiny rakoviny, na liečbu mnohých vírusových ochorení a chrípky. Pri liečbe sa široko používajú interferónové prípravky hepatitída typu A hepatitída B a C: interferón obmedzuje vývoj vírusu, zabraňuje výskytu cirhóza a vylučuje smrť.

Niektoré interferónové lieky majú vedľajšie účinky, ako sú kožné vyrážky, alergie a choroby krvotvorného systému.

Pri dlhodobom používaní interferónu telo produkuje protilátky proti interferónu, čo mu znemožňuje bojovať vírusy. Príčina týchto javov spočíva v prítomnosti albumínu v prípravkoch na báze interferónu.

Albumín sa získava z krvi, takže existuje riziko (aj keď minimálne) infekcie hepatitída a iné krvou prenosné choroby.

stôl 1

Spektrum aktivity interferónu

Názov lieku	Podtyp INF	Spôsob získania	farmakologický účinok	Indikácie na použitie
Interferón		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom vírusov	Antivírusové, imunomodulačné, antiproliferatívne	Vírusové ochorenia, leukémia, malígny melanóm, rakovina obličiek, karcinoidný syndróm
Blokovanie		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom paramykovírusov	Potláča aktivitu množstva vírusov	Vírusové ochorenia očí, hepatitída
Interferón alfa-2		Rekombinantný	Antivírusový, imunomodulačný, inhibuje proliferáciu širokého spektra nádorových buniek	Epiteliálna forma akútnej a rekurentnej vírusovej infekcie oka; onkologické ochorenia
Interferón alfa-2a		Rekombinantný. Proteín obsahujúci 165 aminokyselín	Antivírusová, protinádorová aktivita	Leukemická retikuloendotelióza, Kaposiho sarkóm, rakovina obličiek, rakovina močového mechúra, melanóm, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantný INF produkovaný bakteriálnym kmeňom pseudomonas, ktorého genetický aparát obsahuje gén pre ľudský leukocytový INF b2. Identický s ľudským leukocytom INF b2.		Vírusové, nádorové ochorenia
Interferón alfa - n1		Vysoko purifikovaný ľudský INF	Antivírusový	Chronická aktívna infekčná hepatitída B
Inreferon beta		Superprodukcia ľudských fibroblastov stimulátorom v prítomnosti metabolických inhibítorov	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické vírusové infekcie v oftalmológii, gynekológii a urológii, dermatológii, hepatológii, onkológii
Interferón gama		Rekombinantný	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické granulomatózne ochorenia

INF-bAINF-V navzájom viac podobné. Ich gény sú lokalizované na 9. chromozóme. Na produkciu oboch sú indukujúcim signálom vírusy. Majú výrazný antivírusový a protinádorový účinok a v oveľa menšej miere vykazujú imunomodulačné vlastnosti.

INF-G má výrazný imunomodulačný účinok, spolu s interleukínom-2 (IL-2) a tumor nekrotizujúcim faktorom (TNF alebo TNF) je jedným z hlavných prozápalových cytokínov a je induktorom bunkovej imunity. Antivírusové a protinádorové vlastnosti sú menej výrazné ako vlastnosti INF-b a INF-c. Gén INF-g sa nachádza na 12. chromozóme, hlavné produkujúce bunky sú T-lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky (NK bunky). Indukčný signál na produkciu môže byť akýkoľvek antigén alebo iné cytokíny.

Antivírusový účinok interferónov spočíva v potlačení syntézy vírusovej RNA, potlačení syntézy vírusových obalových proteínov. Mechanizmom tohto účinku je aktivácia intracelulárnych enzýmov, ako je proteínkináza alebo adenylátsyntetáza. Proteínkináza ničí iniciačný faktor syntézy proteínov z messenger RNA, ktorý potláča syntézu proteínov. Adenylátsyntetáza - spôsobuje syntézu látok, ktoré ničia vírusovú RNA.

Imunomodulačný účinok interferónov - schopnosť regulovať interakciu buniek zapojených do imunitnej odpovede. Interferóny plnia túto funkciu reguláciou citlivosti buniek na cytokíny a expresiou molekúl hlavného histokompatibilného komplexu typu I (MHC1) na bunkových membránach. Zvýšená expresia MHC1 na vírusom infikovaných bunkách výrazne zvyšuje pravdepodobnosť, že budú rozpoznané imunokompetentnými bunkami a eliminované z tela. Najvýraznejšie imunomodulačné vlastnosti má INF-g, ktorý je produktom pomocníka T-lymfocytov typu I, spolu s ďalšími prozápalovými cytokínmi aktivuje makrofágy, T-cytotoxické lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky (NK bunky), potláča aktivitu B-lymfocytov, aktivuje prostaglandínový a kortikosteroidný systém. Všetky tieto faktory zosilňujú fagocytárne a cytotoxické reakcie v oblasti zápalového ložiska a prispievajú k účinnej eliminácii infekčného agens.

Protinádorový účinok interferónov spojené s ich schopnosťou spomaliť alebo potlačiť rast bunkových kultúr a aktivovať protinádorové mechanizmy imunitného systému. Táto vlastnosť interferónov bola objavená už dávno a je široko používaná na terapeutické účely. Všetky protinádorové účinky interferónov sú rozdelené na priame a nepriame. Priamo súvisí so schopnosťou priamo pôsobiť na nádorové bunky, ich rast a diferenciáciu. Nepriame sú spojené so zvýšením schopnosti imunokompetentných buniek detekovať a ničiť atypické bunky tela.

Priame protinádorové účinky interferónu:

· Potlačenie syntézy RNA.

· Potlačenie syntézy bielkovín.

· Stimulácia nediferencovaných buniek k dozrievaniu.

· Zvýšená expresia membránových antigénov nádorových buniek a hormonálnych receptorov.

· Porušenie procesov tvorby ciev.

· Neutralizácia onkovírusov.

· Potlačenie účinku nádorových rastových faktorov.

Nepriame protinádorové účinky interferónu:

· Stimulácia aktivity buniek imunitného systému (makrofágy, NK bunky, T-cytotoxické lymfocyty).

· Zvýšená expresia molekúl histokompatibility I. triedy na bunkách.

Antiproliferatívny účinok interferónov spočíva v schopnosti interferónov prejavovať vlastnosti cytostatík – potláčať rast buniek potlačením syntézy RNA a proteínov, ako aj inhibovať rastové faktory stimulujúce bunkovú proliferáciu.

Induktory INF je veľmi rôznorodá skupina prírodných a syntetických zlúčenín, ktoré môžu spôsobiť, že si telo vytvorí vlastný (endogénny) INF. Podobne ako INF majú univerzálne široké spektrum antivírusovej aktivity, ako aj imunomodulačný účinok, ktorý určuje ich účinnosť pri mnohých nevírusových ochoreniach.

tabuľka 2

Spektrum antivírusovej aktivity induktorov INF

Droga	Indikácie na použitie
Akridanony (cykloferón, neovir)	Chrípka, encefalitída, besnota, infekcia HIV, AIDS
Fluorenóny (amixín)	Chrípka, ARVI, herpes, hepatitída A, encefalitída, besnota, skleróza multiplex
Poly (I): poly(U) - ampligén	HIV infekcia, AIDS
Poly(G): poly(C)-polyguacil	Chrípka, hepatitída B, encefalitída, besnota
Dvojvláknová RNA (larifan, ridostin)	Chrípka, ARVI, herpes, encefalitída, besnota
Poly(A): poly(U)-poludán	Herpetické očné lézie
Polyfenoly (megasín, kagocel, savrac, ratosín, gozalidón)	Chrípka. ARVI, herpes, encefalitída, besnota, hepatitída, enterovírusové infekcie

Záver

Interferón je rodina glykoproteínových proteínov, ktoré sú syntetizované bunkami imunitného systému a spojivového tkaniva. V závislosti od toho, ktoré bunky syntetizujú interferón, existujú tri typy: interferóny b, c a g.

Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom; b) geneticky upravené.

V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov "Reaferon". Výroba tohto lieku je v mnohých ohľadoch účinnejšia a lacnejšia ako leukocyty.

Pôsobenie interferónu je tým účinnejšie, čím skôr sa začne syntetizovať alebo vstupuje do tela zvonku. Preto sa používa s preventívny účel s mnohými vírusové infekcie chrípka, ako aj na terapeutické účely pri chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D), herpes, roztrúsená skleróza atď. pozitívne výsledky pri liečbe malígnych nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

Interferóny sú druhovo špecifické, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto druhová špecifickosť je však relatívna.

Bibliografia

1. Dočasný liekopisný článok 42U-23/60-439-97. Ľudský rekombinantný interferón alfa-2.

2. Gavrikov A.V. Optimalizácia biotechnologickej produkcie rekombinantných ľudských interferónových látok - M., 2003,

3. Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Potekhina T.S. Základy farmaceutickej mikrobiológie. Petrohrad: Prospekt Nauki, 2008. -304 s.

4. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Princípy a aplikácia. M.: Mir, 2002. -589 s.

5. Štátny liekopis ZSSR. XI ed., číslo 1.-- S. 175.

6. Štátny register liekov / Ed. A.V. Katlinsky a ďalší - M., 2002.

7. Elinov N.P. Základy biotechnológie. Petrohrad: Nauka.-1995.-600 s.

8. Elinov N.P., Zaikina I.A., Sokolova I.P. Sprievodca laboratórnymi hodinami mikrobiológie - M.: Medicína, 1998.

9. Karabelský A.V. Rekombinantné interferóny.- M.: Book on Demand, 2010.- 132 s.

10. Mashkina O.S., Butorina A.K. Genetické inžinierstvo a biologická bezpečnosť. Voronež: VSU, 2005. 71 s.

11. Naroditsky B.S. Molekulárna biotechnológia interferónov. // zborník vedeckej a praktickej konferencie "Interferón - 50 rokov". - M., 2007, s. 17-23

12. Základy farmaceutickej biotechnológie: Učebnica / T.V. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L, K. Michaleva, L.S. Belova - Rostov n/a: Phoenix; Tomsk: Vydavatestvo NTL, 2006.- 256 s.

13. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. a ďalšie. Účinnosť rekombinantného alfa-dva-interferónu pri vírusovej hepatitíde B // Medical Affairs.- Kyiv, 1990.- No. 9.-- S. 105-108.

14. http://interferon.su/php/content.php?id=577

15. http://ru-patent.info/20/95-99/2098124.html

16. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

17. www.pharmvestnik.ru

Uverejnené na Allbest.ru

...

Podobné dokumenty

Triedy interferónov: prirodzene sa vyskytujúce a umelo syntetizované. Spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov darcovskej krvi a mikrobiologická syntéza. Mechanizmy účinku interferónov, terapeutické využitie.

abstrakt, pridaný 27.01.2010

História objavu interferónov, ich charakteristiky, klasifikácia, mechanizmus účinku a vlastnosti produkcie; klinické znaky ich použitia. Technologická schéma na produkciu leukocytov a rekombinantného interferónu v preparatívnych množstvách.

kurzová práca, pridané 23.12.2012

Vrodená antivírusová imunita. Typy interferónov a mechanizmy antivírusového účinku interferónov. Schopnosť protilátok a komplementov obmedziť šírenie vírusu a zabrániť opätovnej infekcii. Obídenie imunologickej kontroly vírusmi.

abstrakt, pridaný 27.09.2009

Štúdium vlastností interferónu. Štúdium hlavných účinkov proteínu, ktorý má antivírusové, antiproliferatívne a imunomodelujúce účinky. Použitie interferónu pri liečbe malígnych nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

prezentácia, pridané 17.11.2015

Proces transfúzie krvi a jej účel, hodnotenie bezpečnosti v súčasnom štádiu vývoja medicíny. Patologický účinok darcovskej krvi, jeho príčiny a spôsoby rehabilitácie pacienta. Použitie reinfúzie a autohemotransfúzie krvi a ich výhody.

abstrakt, pridaný 13.07.2009

Typy imunomodulácie. Pojem imunotropný lieky. Interferóny a ich induktory. Mechanizmus imunomodulačného účinku bakteriálnych vakcín. Indikácie na predpisovanie a-IF liekov. Kontraindikácie liečby interferónovými liekmi.

prezentácia, pridané 04.03.2014

Analýza krvných buniek: červené krvinky, leukocyty, krvné doštičky. Hemoglobín a jeho funkcie v tele. Granulocyty, monocyty a lymfocyty ako zložky leukocytov. Patológie v zložení krvi, ich vplyv na funkcie ľudského tela.

abstrakt, pridaný 10.06.2008

Liečebný a profylaktický mechanizmus účinku liečebného bahna, ich klasifikácia a využitie za účelom tepelných účinkov na organizmus. Indikácie a kontraindikácie pre tepelnú terapiu. Techniky pre všeobecné a lokálne aplikácie bahna a kúpeľov.

abstrakt, pridaný 21.12.2014

Funkcie krvo-tekutého tkaniva kardiovaskulárneho systému stavovcov. Jeho zloženie a tvarové prvky. Tvorba červených krviniek, typy patológií. Hlavná sféra pôsobenia leukocytov. Lymfocyty sú hlavnými bunkami imunitného systému. Zmeny v krvi súvisiace s vekom.

prezentácia, pridané 14.10.2015

Veková periodizácia človeka. Hematopoéza v embryogenéze. Zmeny v koncentrácii erytrocytov, leukocytov, lymfocytov a krvných doštičiek s vekom. Špecifická hmotnosť a viskozita krvi u novorodencov a starších ľudí. Klasifikácia a načasovanie vývoja leukocytov.

Interferóny- glykoproteíny produkované bunkami ako odpoveď na vírusovú infekciu a iné podnety. Blokujú reprodukciu vírusu v iných bunkách a podieľajú sa na interakcii buniek imunitného systému. Existujú dve sérologické skupiny interferónov: typ I - IFN-α a IFN-β; Typ II - IFN-.y Interferóny typu I majú antivírusové a protinádorové účinky, zatiaľ čo interferón typu II reguluje špecifickú imunitnú odpoveď a nešpecifickú rezistenciu.

α-interferón (leukocyt) je produkovaný leukocytmi ošetrenými vírusmi a inými činidlami. β-interferón (fibroblast) je produkovaný fibroblastmi ošetrenými vírusmi.

IFN typu I ich väzbou na zdravé bunky chráni pred vírusmi. Antivírusový účinok IFN typu I môže byť tiež spôsobený skutočnosťou, že je schopný inhibovať bunkovú proliferáciu interferenciou so syntézou aminokyselín.

IFN-γ je produkovaný T lymfocytmi a NK bunkami. Stimuluje aktivitu T- a B-lymfocytov, monocytov/makrofágov a neutrofilov. Indukuje apoptózu aktivovaných makrofágov, keratinocytov, hepatocytov, buniek kostnej drene, endotelových buniek a potláča apoptózu periférnych monocytov a neurónov infikovaných herpesom.

Geneticky upravený leukocytový interferón sa vyrába v prokaryotických systémoch (Escherichia coli). Biotechnológia na výrobu leukocytového interferónu zahŕňa nasledujúce kroky: 1) ošetrenie leukocytovej hmoty induktormi interferónu; 2) izolácia zmesi mRNA z ošetrených buniek; 3) získanie celkovej komplementárnej DNA použitím reverznej transkriptázy; 4) inzercia cDNA do plazmidu E. coli a jeho klonovanie; 5) výber klonov obsahujúcich interferónové gény; 6) zahrnutie silného promótora do plazmidu pre úspešnú transkripciu génu; 7) expresia génu interferónu, t.j. syntéza zodpovedajúceho proteínu; 8) deštrukcia prokaryotických buniek a purifikácia interferónu pomocou afinitnej chromatografie.

Interferóny uplatniť na prevenciu a liečbu množstva vírusových infekcií. Ich účinok je určený dávkou lieku, ale vysoké dávky interferónu majú toxický účinok. Interferóny sa široko používajú pri chrípke a iných akútnych respiračných ochoreniach. Liečivo je účinné v počiatočných štádiách ochorenia a aplikuje sa lokálne. Interferóny majú terapeutický účinok proti hepatitíde B, herpesu a tiež proti malígnym novotvarom.

Interferón označuje dôležité ochranné proteíny imunitného systému. Objavený počas štúdia vírusovej interferencie, t.j. javu, keď sa zvieratá alebo bunkové kultúry infikované jedným vírusom stali necitlivými na infekciu iným vírusom. Ukázalo sa, že rušenie je spôsobené výsledným proteínom, ktorý má ochranné antivírusové vlastnosti. Tento proteín sa nazýval interferón.

Alfa interferón produkovaný leukocytmi a nazýva sa leukocyt; beta interferón nazývaný fibroblastický, pretože ho syntetizujú fibroblasty – bunky spojivového tkaniva, a gama interferón- imunitný, keďže ho produkujú aktivované T-lymfocyty, makrofágy, prirodzené zabíjačské bunky, t.j. imunitné bunky.

Interferón sa v tele neustále syntetizuje a jeho koncentrácia v krvi sa udržiava na približne 2 IU/ml (1 medzinárodná jednotka - IU - je množstvo interferónu, ktoré chráni bunkovú kultúru pred 1 CPD 50 vírusu). Produkcia interferónu sa prudko zvyšuje počas infekcie vírusmi, ako aj pri vystavení induktorom interferónu, ako je RNA, DNA a komplexné polyméry. Takéto induktory interferónu sa nazývajú interferonogény.

Okrem antivírusového účinku má interferón protinádorovú ochranu, pretože odďaľuje proliferáciu (reprodukciu) nádorových buniek, ako aj imunomodulačnú aktivitu, stimuluje fagocytózu, prirodzené zabíjačské bunky, reguluje tvorbu protilátok B bunkami, aktivuje expresiu hl. histokompatibilný komplex.

Mechanizmus akcie interferón je komplexný. Interferón priamo neovplyvňuje vírus mimo bunky, ale viaže sa na špeciálne bunkové receptory a ovplyvňuje proces rozmnožovania vírusu vo vnútri bunky v štádiu syntézy proteínov.

Použitie interferónu. Pôsobenie interferónu je tým účinnejšie, čím skôr sa začne syntetizovať alebo vstupuje do tela zvonku. Preto sa používa na profylaktické účely pri mnohých vírusových infekciách, ako je chrípka, ako aj na terapeutické účely pri chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D), herpes, roztrúsená skleróza atď. Interferón dáva pozitívny výsledky pri liečbe zhubných nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

Interferóny sú druhovo špecifické, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto druhová špecifickosť je však relatívna.

Príjem interferónu. Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom, v dôsledku čoho infikované bunky syntetizujú interferón, ktorý sa potom izoluje a z neho sa skonštruujú interferónové prípravky; b) geneticky upravené - pestovaním rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón za produkčných podmienok. Typicky sa používajú rekombinantné kmene pseudomonas a Escherichia coli s interferónovými génmi zabudovanými do ich DNA. Interferón získaný genetickým inžinierstvom sa nazýva rekombinantný. V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov „Reaferon“. Výroba tohto lieku je v mnohých ohľadoch efektívnejšia a lacnejšia ako liek na báze leukocytov.

Rekombinantný interferón našiel široké použitie v medicíne ako preventívne a terapeutické činidlo na vírusové infekcie, novotvary a imunodeficiencie.