Reakcia je založená na skutočnosti, že imunitné séra sú ošetrené fluorochrómmi (FITC), ktoré sú kombinované s protilátkami. Séra nestrácajú svoju imunitnú špecifickosť. Keď výsledné luminiscenčné sérum interaguje s príslušným antigénom, vytvorí sa špecifický svetelný komplex, ktorý je ľahko viditeľný v luminiscenčnom mikroskope.

Na priamu a nepriamu imunofluorescenciu možno použiť rôzne imunofluorescenčné séra. Pri priamej metóde sa pre každý mikrób pripravia špecifické fluorescenčné imunitné séra imunizáciou králika usmrtenou kultúrou patogénu, potom sa králičie imunitné sérum spojí s fluorochrómom (fluoresceín izokyanát alebo izotiokyanát). Metóda sa používa na expresnú diagnostiku za účelom detekcie bakteriálnej resp vírusové antigény.

Nepriama metóda zahŕňa použitie nefluorescenčného diagnostického imunitného séra (imunizovaný králik alebo chorá osoba) a fluorescenčného séra obsahujúceho protilátky proti diagnostickým druhom globulínov v sére.

Úloha č. 3

Enzýmová imunoanalýza (IFA)

Široko používaný je enzýmový imunosorbentový test (ELISA). Je založená na skutočnosti, že proteíny sú silne adsorbované na platniach, napríklad z polyvinylchloridu. Jeden z najbežnejších variantov ELISA v praxi je založený na použití enzýmom značených špecifických protilátok rovnakej špecifickosti. K nosiču s imobilizovanými protilátkami sa pridá roztok s analyzovaným antigénom. Počas inkubácie sa na pevnej fáze vytvoria špecifické komplexy antigén-protilátka. Potom sa nosič vymyje z nenaviazaných zložiek a pridajú sa homologické protilátky značené enzýmom, ktoré sa viažu na voľné valencie antigénu v komplexoch. Po druhej inkubácii a odstránení nadbytku týchto enzýmom značených protilátok sa stanoví enzymatická aktivita na nosiči, ktorej hodnota bude úmerná počiatočnej koncentrácii študovaného antigénu.

V inom variante ELISA sa testovacie sérum pridá k imobilizovanému antigénu. Po inkubácii a odstránení nenaviazaných zložiek pomocou enzýmom značených antiglobulínových protilátok sa detegujú špecifické imunokomplexy. Táto schéma je jednou z najbežnejších v prostredí ELISA.

Špecifický testovací materiál – špecifický protilátkový substrát

protilátky patogén s peroxidázou pre peroxidázu

Skúmaný AGS, označený

sérová peroxidáza Substrát pre

Špecifická peroxidáza

ovládanie:

pozitívne - imúnne sérum značené peroxidázou + substrát - 2 jamky;

negatívne - normálne sérum + substrát - 2 jamky.

Prvýkrát navrhnutý Coombsom v roku 1942. RIF je založený na detekcii antigénov v klinickom materiáli, preparátoch krvných buniek atď. pomocou monoklonálnych protilátok alebo séra značeného fluorochrómom (priame RIF). Prvé (diagnostické) protilátky možno detegovať pomocou anti-imunoglobulínového séra značeného fluorochrómmi (nepriamy RIF). Existujú modifikácie RIF na detekciu protilátok proti infekčné agens v sére alebo protilátky v sére.

Popularita RIF je spôsobená jeho nákladovou efektívnosťou, prítomnosťou široký rozsah diagnostické súpravy, rýchla odozva. Dnes sa pri tejto reakcii používajú polyklonálne séra aj monoklonálne protilátky značené fluoresceín izotiokyanátom (FITC). Na zníženie nešpecifickej luminiscencie pozadia sa prípravky ošetria hovädzím sérovým albumínom značeným rodamínom alebo Evansovou modrou.

Najčastejšie sa RIF používa na rýchlu detekciu patogénu v patologickom materiáli. V tomto prípade sa z testovaného materiálu pripraví náter na podložnom sklíčku ako pri bežnej mikroskopii. Prípravok sa fixuje metylalkoholom, acetónom alebo iným chemickým fixátorom. Na povrch fixovaného náteru sa aplikujú séra značené FITC alebo monoklonálne protilátky (v prípade nepriamej RIF sa liek najskôr ošetrí sérom proti požadovanému antigénu a potom značenými protilátkami proti imunoglobulínom použitým v prvej fáze). Pretože RIF je typom heterogénnej analýzy, jeden stupeň je oddelený od druhého premývaním.

Započítanie výsledkov reakcie sa uskutočňuje pomocou fluorescenčného mikroskopu, v optický systém v ktorom je nainštalovaná sada svetelných filtrov, ktoré zabezpečujú osvetlenie prípravku ultrafialovým alebo modrofialovým svetlom s danou vlnovou dĺžkou. Výskumník hodnotí charakter žiary, tvar, veľkosť predmetov a ich vzájomnú polohu.

Pri nastavení RIF na detekciu protilátok sa pripravia nátery z referenčného kmeňa patogénu. Testovacie sérum sa aplikuje na náter. Ak obsahuje požadované protilátky, potom sa viažu na antigény mikrobiálnych buniek. Premytím prípravku tlmivým roztokom sa odstránia nenaviazané protilátky. Potom sa liek ošetrí značeným sérom proti ľudským imunoglobulínom. V prípade pozitívneho výsledku reakcie sa pozoruje špecifická žiara referenčnej kultúry pri mikroskopickom nátere vo fluorescenčnom mikroskope.

Hlavnou nevýhodou RIF je jeho subjektivita.

Klasické kritériá pre špecifickosť tejto reakcie sú:

charakteristická morfológia, veľkosť a umiestnenie patogénu v nátere;

periférny charakter žiary objektu;

fluorescenčná farba;

intenzita fluorescencie.

Pri štúdiu veľkých objektov (Trichomonas, ľudské bunky, bunky ovplyvnené baktériami alebo vírusmi) vám tieto kritériá umožňujú získať spoľahlivý výsledok. Zároveň majú elementárne telieska chlamýdií a mykoplazmov veľkosti, ktoré ležia na hranici rozlišovacej schopnosti luminiscenčného mikroskopu. Zároveň je ťažké posúdiť morfológiu mikroorganizmov a luminiscencia stráca periférny charakter. Zostávajúce kritériá zjavne nestačia na spoľahlivú identifikáciu pozorovaného mikroorganizmu. V súvislosti s vyššie uvedeným subjektívny charakter zohľadnenia reakcie kladie osobitné požiadavky na kvalifikáciu personálu vykonávajúceho štúdiu.

2.2. Časovo rozlíšený fluorescenčný imunotest (FIA BP, Etkins R. a Wallac O., 1984)

Tento typ FIA je založený na princípoch sorpcie jedného z činidiel na tuhej fáze a použití „sendvičovej“ technológie, t.j. dvojité rozpoznávanie, podobne ako ELISA. Avšak dôležitý rozdiel metódou je použitie chelátov lantanoidov (prvky vzácnych zemín európium, samárium, terbium a dysprózium) ako označenie. Výhody FIA VR sú jeho vysoká citlivosť, technológia nastavenia podobná ELISA a potenciál pre výrazné zosilnenie užitočného signálu vďaka veľmi vysokému odstupu signálu od šumu. Špecifická fluorescenčná značka fluoreskuje nemerateľne silnejšie a dlhšie ako fluorescencia pozadia. Okrem toho má štítok schopnosť obnoviť schopnosť žiariť (na účtovanie sa používa pulzné excitačné žiarenie s periódou 1 s - viac ako 1000 impulzov), čo vedie k akumulácii (zosilneniu) užitočného signálu. Opísaný systém implementuje PerkinElmer, USA, pod názvom Delfia a má citlivosť viac ako 10 -17 M pri stanovení antigénov.

2.3. Prietoková cytometria

V súčasnosti sú široko používané sérologické testy, na ktorých sa podieľajú značené AG alebo AT-la. Patria sem imunofluorescenčné reakcie, rádioimunitné a enzýmové imunoanalýzy.

Uplatňujú sa:

1) na sérodiagnostiku infekčné choroby t.j. na detekciu protilátok pomocou súboru známych konjugovaných (chemicky kombinovaných) antigénov s rôznymi značkami (enzýmy, fluorochrómové farbivá);

2) na stanovenie mikroorganizmu alebo jeho sérovaru pomocou štandardne značených diagnostických protilátok (rýchla diagnostika).

Séra sa pripravujú imunizáciou zvierat zodpovedajúcimi antigénmi, potom sa izolujú imunoglobulíny a konjugujú sa so svetelnými farbivami (fluorochrómami), enzýmami a rádioizotopmi.

Označené SR nie sú v špecificite horšie ako iné SR a svojou citlivosťou prevyšujú všetky SR.

Žiadny súvisiaci obsah

Ako etiketa sa používajú svietiace fluorochrómové farbivá (fluorisceín izotiokyanát atď.).

Existujú rôzne modifikácie RIF. Na expresnú diagnostiku infekčných chorôb - na detekciu mikróbov alebo ich antigénov v testovanom materiáli sa používa RIF podľa Koonsa.

Existujú dve metódy RIF podľa Koonsa: priame a nepriame.

Priame komponenty RIF:

1) skúmaný materiál (črevný pohyb oddelený nosohltanom atď.);

2) označené špecifické imunitné sérum obsahujúce AT-la na požadovaný antigén;

3) izotonický roztok chloridu sodného.

Rozter z testovaného materiálu sa ošetrí značeným antisérom.

Dochádza k AG-AT reakcii. So žiarivkou mikroskopické vyšetrenie v oblasti, kde sú lokalizované komplexy AG-AT, je detekovaná fluorescencia - žiara.

Nepriame komponenty RIF:

1) študovaný materiál;

2) špecifické antisérum;

3) antiglobulínové sérum (AT-la proti imunoglobulínu) označené fluorochrómom;

4) Izotonický roztok chloridu sodného.

Náter z testovaného materiálu sa najskôr ošetrí imunitným sérom na požadovaný antigén a potom značeným antiglobulínovým sérom.

Svetelné komplexy AG-AT - značené AT sa detegujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Výhodou nepriamej metódy je, že nie je potrebné pripravovať široké spektrum fluorescenčných špecifických sér a používa sa iba jedno fluorescenčné antiglobulínové sérum.

Izoluje sa aj 4-zložková odroda nepriameho RIF, keď sa dodatočne zavedie komplement (sérum morské prasa). O pozitívna reakcia vzniká AG-AT komplex - označený - AT-komplement.

RIF je založený na kombinácii antigénov baktérií, rickettsie a vírusov so špecifickými protilátkami značenými fluorescenčnými farbivami (fluoresceín izotiokyanát, rodamín, B-izotiokyanit, lyssatinrodamín B-200, sulfochlorid atď.) s reaktívnymi skupinami (sulfochlorid, izotiokyanit atď. .). Tieto skupiny sa kombinujú s voľnými aminoskupinami molekúl protilátok, ktoré pri pôsobení fluorochrómu nestrácajú svoju špecifickú afinitu k zodpovedajúcemu antigénu. Výsledné AG-AT komplexy sa pod fluorescenčným mikroskopom stávajú jasne viditeľnými, jasne svietiacimi štruktúrami (obr. 7). RIF dokáže detekovať malé množstvá bakteriálnych a vírusových antigénov. Metóda RIF sa používa v dvoch verziách: priama a nepriama metóda.

Priama metóda je založená na priamom spojení antigénu so značenou protilátkou. Nepriama metóda je založená na fázovej detekcii komplexu AG-AT pomocou fluorescenčných farbív. Prvý stupeň spočíva vo vytvorení imunitných komplexov určitého antigénu so špecifickými protilátkami. Druhou fázou je identifikácia tohto komplexu jeho ošetrením značeným antigamaglobulínom.

Výhodou RIF je jednoduchosť, vysoká citlivosť, rýchlosť získania výsledku. RIF sa používa ako metóda na včasnú expresnú diagnostiku chrípky, dyzentérie, malárie, moru, tularémie, syfilisu atď. Na uskutočnenie takejto štúdie sa používa luminiscenčný mikroskop.

Rádioimunoanalýza (RIA)

RIA je jednou z najcitlivejších metód imunodiagnostiky. Používa sa na detekciu antigénu vírusu hepatitídy B u pacientov s vírusovou hepatitídou. Na tento účel sa do testovacieho séra pridá referenčné sérum (sérum obsahujúce protilátky proti vírusu hepatitídy B). Zmes sa inkubuje 1-2 dni pri teplote 40 °C, potom sa pridá referenčný antigén (antigén značený izotopom 125J) a inkubácia pokračuje ďalších 24 hodín. Do výsledného komplexu antigén-protilátka sa pridávajú zrážacie antiimunoglobulíny proti referenčným sérovým proteínom, čo vedie k vytvoreniu precipitátu (obr. 8). Výsledok sa berie do úvahy prítomnosťou a počtom impulzov v zrazenine zaznamenaných počítadlom. Ak je v testovacom sére antigén naviazaný na špecifické protilátky, tieto sa neviažu na značený antigén, a preto sa v precipitáte nezistí. RIA je teda založená na princípe kompetitívnej interakcie stanoveného antigénu a známeho množstva značeného antigénu s aktívnymi centrami protilátok, ako značenie sa používajú rádioaktívne izotopy.

V závislosti od techniky stagingu sa rozlišujú dve metódy RIA.

1) Technika „kvapalná fáza“ (klasická RIA). Nevýhodou tejto inscenačnej techniky je potreba

špeciálna separácia voľných a viazaných značených antigénov (alebo protilátok).

2) Technika „tuhá fáza“.

AG alebo AT známej špecifickosti sa viaže na sorbenty (tuhá fáza) - steny polystyrénovej jamky alebo plastovej rúrky. Zvyšok IC komponentov sa postupne sorbuje na imobilizovaný AG (AT).

V závislosti od povahy reakcie sa rozlišujú tieto metódy:

1) Konkurenčná metóda – metóda založená na konkurencii AG.

Zložky reakcie:

a) detekovateľné AG (testovaný materiál - krv, spútum atď.);

b) antigén značený rádioizotopom, identický so študovaným antigénom;

c) špecifické protilátky známej koncentrácie naviazané na sorbent;

d) štandardná AG (kontrola);

e) tlmivý roztok.

Najprv sa do reakcie zavedie študovaný AG. Na povrchu sorbentu sa vytvára komplex AG-AT. Sorbent sa premyje, potom sa vstrekne označený antigén, viac obsahuštudovaný AG, menej značený AG sa viaže na AT-m na povrchu sorbentu. Koncentrácia značeného antigénu sa stanoví meraním rádioaktivity reakcie pomocou počítačov. Hodnota rádioaktivity reakcie bude nepriamo úmerná množstvu AG v testovanej vzorke.

2) Nekonkurenčná metóda.

Zložky reakcie:

a) určená AG;

b) špecifický AT-a známej koncentrácie, viazaný

nye na sorbente;

c) protilátky identické s naviazanou protilátkou, označené

rádioizotop;

d) štandardná AG;

e) tlmivý roztok.

Študovaný AG sa pridá k naviazaným protilátkam. V procese inkubácie sa na sorbente vytvárajú komplexy AG-AT. Sorbent sa vymyje z voľných zložiek a pridajú sa značené protilátky, ktoré sa viažu na voľné valencie AG-on v komplexe. Množstvo rádioaktivity je úmerné koncentrácii študovaného AG.

3) "Sendvičová metóda" (nepriama metóda) - najbežnejšia metóda.

Komponenty:

a) testovacie sérum (alebo test AG);

b) AG viazané na sorbent (alebo AT-la viazané na sorbente pri stanovení AG-a);

c) diagnostické protilátky proti imunoglobulínom značeným rádioizotopmi;

d) kontrolné séra (alebo antigény);

e) tlmivé roztoky.

Sledované protilátky (alebo AG) reagujú s AG na pevnej fáze (AT), potom sa inkubát odstráni a do reakcie sa zavedú značené antiglobulínové protilátky, ktoré sa viažu na špecifické AG-AT komplexy na povrchu sorbentu. Veľkosť rádioaktivity reakcie je priamo úmerná množstvu študovaného AT (alebo AG).

Výhody RIA:

1) vysoká špecifickosť a citlivosť;

2) jednoduchosť techniky nastavenia;

3) presnosť kvantitatívneho hodnotenia výsledkov;

4) ľahko sa automatizuje.

Nevýhoda: použitie rádioaktívnych izotopov.

Žiadny súvisiaci obsah

Metóda ELISA (ELISA)

Metóda sa používa na detekciu antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných so značeným enzýmom (chrenová peroxidáza, b - galaktóza resp. alkalický fosfát). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát a chromogén. Substrát je štiepený enzýmom a jeho produkty degradácie spôsobujú chemickú modifikáciu chromogénu. V tomto prípade chromogén mení svoju farbu – intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky (obr. 9).

Najbežnejšia je ELISA na pevnej fáze, pri ktorej je jedna zo zložiek imunitnej odpovede (antigén alebo protilátka) adsorbovaná na pevnom nosiči. Ako pevný nosič sa používajú polystyrénové mikropanely. Pri stanovení protilátok sa do jamiek s adsorbovaným antigénom postupne pridáva krvné sérum pacientov, antiglobulínové sérum značené enzýmom a zmes roztokov substrátu pre enzým a chromogén. Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá z jamiek odstránia dôkladným premytím. O pozitívny výsledok farba roztoku chromogénu sa mení. Nosič v tuhej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkou. Potom sa požadovaný antigén zavedie do jamiek so sorbovanými protilátkami, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá zmes substrátových roztokov pre enzým a chromogén.

ELISA sa používa na diagnostiku ochorení spôsobených vírusovými a bakteriálnymi patogénmi Ako označenie sa používajú enzýmy: peroxidáza, alkalická fosfatáza atď.

Indikátorom reakcie je schopnosť enzýmov vyvolať farebné reakcie, keď sú vystavené príslušnému substrátu. Napríklad substrátom pre peroxidázu je roztok ortofenyldiamínu.

Najpoužívanejšia ELISA na pevnej fáze. Podstata ELISA je podobná ako RIA.

Výsledky ELISA je možné hodnotiť vizuálne a meraním optickej hustoty na spektrofotometri.

Výhody ELISA zahŕňajú:

Žiadny kontakt s rádioaktívnymi látkami;

Jednoduchosť metód hodnotenia odozvy;

Stabilita konjugátov;

Ľahko prístupné automatizácii.

V porovnaní s RIA však viac nízka citlivosť metóda, ale v niektorých prípadoch je citlivosť lepšia ako RIF a RIM.

Nasledujúce typy ELISA sú uvedené ako príklady:

konkurenčný typ.

Vymenovanie.

Určené na identifikáciu povrchový antigén vírus hepatitídy B (HBs Ad) v sére a plazme počas diagnózy vírusová hepatitída B a definície operátora HB5 Ad.

Komponenty:

1) testovací materiál sérum alebo krvná plazma;

2) protilátky proti HB3 Ad adsorbované na povrchu jamky polystyrénovej mikrodoštičky;

3) konjugát - myšacie monoklonálne protilátky proti HB3 Ad značené peroxidázou,

4) ortofenyléndiamín (OPD)-substrát;

5) fyziologický roztok pufrovaný fosfátom;

6) kontrolné séra:

Pozitívne (sérum s HBe Ad);

Negatívne (sérum bez HBs Ad). Pokrok

1) Zavedenie kontrolných a testovacích sér.

2) Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

3) Umývanie studní.

4) Zavedenie konjugátu.

5) Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

6) Umývanie studní.

7) Zavedenie OFD. V prítomnosti HBs Ad roztok v jamkách zožltne.

ELISA sa berie do úvahy pomocou optickej hustoty pomocou fotometra. Stupeň optickej hustoty bude nepriamo úmerný koncentrácii študovaného HBs Ad.

Mechanizmus

Reakcia prebieha v troch fázach:

1) HB3 Krvný tlak študovaného séra (plazmy) sa viaže na homologické protilátky adsorbované na povrchu jamky. Vytvorí sa IR AG-AT. (NVz Ad - agl \ NVz AT).

2) Protilátky HBs Ad značené peroxidázou sa viažu na zostávajúce voľné determinanty HBs Ad komplexu AG-AT. Vytvorí sa komplex AT-AG-značených Abs (!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs Abs značené peroxidázou).

3) OPD interaguje (s peroxidázou) komplexu AT-AG-AT a dochádza k žltému sfarbeniu.

nepriamy typ

Je to hlavná testovacia reakcia na diagnostiku infekcie HIV.

Účel: sérologická diagnostika HIV infekcie - detekcia protilátok proti HIV antigénom, Komponenty:

1) testovací materiál - krvné sérum;

2) syntetické

Imunofluorescenčná metóda (RIF, imunofluorescenčná reakcia, Koonsova reakcia) je metóda na detekciu špecifických antigénov pomocou protilátok konjugovaných s fluorochrómom. Má vysokú citlivosť a špecifickosť.

Používa sa na expresnú diagnostiku infekčných ochorení (identifikácia patogénu v testovanom materiáli), ako aj na stanovenie protilátok a povrchových receptorov a markerov leukocytov (imunofenotypizácia) a iných buniek.

Detekcia bakteriálnych a vírusových antigénov v infekčných materiáloch, živočíšnych tkanivách a bunkových kultúrach pomocou fluorescenčných protilátok (séra) bola prijatá široké uplatnenie v diagnostickej praxi. Príprava fluorescenčných sér je založená na schopnosti niektorých fluorochrómov (napríklad fluoresceín izotiokyanát) vstúpiť do chemickej väzby so sérovými proteínmi bez narušenia ich imunologickej špecifickosti.

Existujú tri typy metód: priama, nepriama, s doplnkom. Priama metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrené takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž okraja bunky vo forme zeleného okraja.

Nepriama metóda RIF spočíva v identifikácii komplexu antigén-protilátka pomocou antiglobulínového (protilátkového) séra označeného fluorochrómom. Na tento účel sa nátery zo suspenzie mikróbov ošetria protilátkami antimikrobiálneho králičieho diagnostického séra. Potom sa protilátky, ktoré nie sú naviazané na mikrobiálne antigény, vymyjú a protilátky zostávajúce na mikróboch sa detegujú ošetrením náteru antiglobulínovým (antikráličím) sérom značeným fluorochrómmi. V dôsledku toho sa vytvorí komplexný mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + anti-králičie protilátky značené fluorochrómom. Tento komplex sa pozoruje vo fluorescenčnom mikroskope, ako pri priamej metóde.

Mechanizmus. Na podložnom skle sa pripraví náter z testovaného materiálu, fixuje sa na plameň a ošetrí sa imúnnym králičím sérom obsahujúcim protilátky proti antigénom patogénov. Na vytvorenie komplexu antigén-protilátka sa prípravok umiestni do vlhkej komory a inkubuje sa pri 37 °C počas 15 minút, potom sa dôkladne premyje izotonickým roztokom chloridu sodného, ​​aby sa odstránili protilátky, ktoré nie sú naviazané na antigén. Potom sa na prípravok aplikuje fluorescenčné antiglobulínové sérum proti králičím globulínom, inkubuje sa 15 minút pri 37 °C a potom sa prípravok dôkladne premyje izotonickým roztokom chloridu sodného. Následkom väzby fluorescenčného antiglobulínového séra so špecifickými protilátkami fixovanými na antigén vznikajú svetielkujúce komplexy antigén-protilátka, ktoré sa detegujú fluorescenčnou mikroskopiou.

4. V ovzduší detskej izby škôlky bolo nájdených 75 mt/m3 streptokoka, 12 mt/m3 stafylokoka a 1 mt/m3 baktérií tuberkulózy. Uveďte hygienicko-bakteriologické posúdenie ovzdušia a načrtnite plán jeho sanitácie.

LÍSTOK NA SKÚŠKU č._54

Retrovírusy. Infekcia HIV (AIDS) a jej patogény.

Vírus ľudskej imunodeficiencie spôsobuje infekciu HIV, čo vedie k rozvoju syndrómu získanej imunitnej nedostatočnosti.

Pôvodcom infekcie HIV je lymfotropný vírus patriaci do čeľade Retroviridae z rodu Lentivirus.

Morfologické vlastnosti: Vírus obsahujúci RNA. Vírusová častica guľovitého tvaru Škrupina pozostáva z dvojitej vrstvy lipidov preniknutých glykoproteínmi. Lipidový obal pochádza z plazmatickej membrány hostiteľskej bunky, v ktorej sa vírus rozmnožuje. Molekula glykoproteínu pozostáva z 2 podjednotiek umiestnených na povrchu viriónu a prenikajúcich do jeho lipidového obalu.

Jadro vírusu má tvar kužeľa a pozostáva z kapsidových proteínov, množstva matricových proteínov a proteázových proteínov. Genóm tvorí dve vlákna RNA, pre realizáciu procesu reprodukcie má HIV reverznú transkriptázu alebo reverznú transkriptázu.

Vírusový genóm pozostáva z 3 hlavných štruktúrnych génov a 7 regulačných a funkčných génov. Funkčné gény vykonávajú regulačné funkcie a zabezpečujú realizáciu reprodukčných procesov a účasť vírusu na infekčnom procese.

Vírus postihuje najmä T- a B-lymfocyty, niektoré bunky monocytovej série (makrofágy, leukocyty), bunky nervového systému.

Kultúrne vlastnosti: na bunkovej kultúre T-lymfocytov a ľudských monocytov (v prítomnosti IL-2).

Antigénna štruktúra: 2 typy vírusu - HIV-1 a HIV-2 HIV-1, má viac ako 10 genotypov (subtypov): A, B, C, D, E, F ..., líšia sa zložením aminokyselín bielkoviny.

HIV-1 sa delí na 3 skupiny: M, N, O. Väčšina izolátov patrí do skupiny M, v ktorej sa rozlišuje 10 podtypov: A, B, C, D, F-l, F-2, G, H, I, K. Odolnosť : Citlivý na fyzikálne a chemické faktory, pri zahriatí podlieha skaze. Vírus môže dlho pretrvávať v sušenom stave, v zaschnutej krvi.

Faktory patogenity, patogenéza: Vírus sa prichytí na lymfocyt, prenikne do bunky a rozmnoží sa v lymfocyte. V dôsledku reprodukcie HIV v lymfocytoch sa lymfocyty zničia alebo stratia funkčné vlastnosti. V dôsledku reprodukcie vírusu v rôznych bunkách sa hromadí v orgánoch a tkanivách a nachádza sa v krvi, lymfe, slinách, moči, pote a výkaloch.

Pri infekcii HIV sa znižuje počet T-4 lymfocytov, je narušená funkcia B-lymfocytov, je potlačená funkcia prirodzených zabíjačov a znižuje sa odpoveď na antigény a je znížená tvorba komplementu, lymfokínov a iných faktorov, ktoré regulujú imunitné funkcie (IL). narušená, čo má za následok dysfunkciu imunitného systému.

Klinika: postihnutá dýchací systém(pneumónia, bronchitída); CNS (abscesy, meningitída); Vyskytuje sa gastrointestinálny trakt (hnačka), zhubné novotvary (nádory vnútorných orgánov).

Infekcia HIV prebieha v niekoľkých štádiách: 1) inkubačná doba v priemere 2-4 týždne; 2) štádium primárnych prejavov, charakterizovaných najskôr akútna horúčka, hnačka; štádium končí asymptomatickou fázou a pretrvávaním vírusu, obnova pohody, v krvi sa však zisťujú HIV protilátky, 3) štádium sekundárnych ochorení, prejavujúcich sa poškodením dýchacieho, nervového systému. Infekcia HIV končí posledným, 4. terminálnym štádiom – AIDS.

Mikrobiologická diagnostika.

Virologické a sérologické štúdie zahŕňajú spôsoby stanovenia HIV antigénov a protilátok. Na tento účel sa používajú ELISA, IB a PCR. Séra pacientov s HIV-1 a HIV-2 obsahujú protilátky proti všetkým vírusovým proteínom. Na potvrdenie diagnózy sa však stanovujú protilátky proti proteínom gp41, gpl20, gpl60, p24 v HIV-1 a protilátky proti proteínom gp36, gpl05, gpl40 v HIV-2. Protilátky proti HIV sa objavia 2-4 týždne po infekcii a sú zistiteľné vo všetkých štádiách HIV.

Metóda detekcie vírusu v krvi, lymfocytoch. Pri každej pozitívnej vzorke sa však na potvrdenie výsledkov vykoná IB reakcia. Používa sa aj PCR, ktorá dokáže odhaliť infekciu HIV v inkubačnej a včasnej klinickej fáze, ale jej citlivosť je o niečo nižšia ako pri ELISA.

Klinické a sérologické diagnózy sú potvrdené imunologické štúdie ak poukazujú na prítomnosť imunodeficiencie u vyšetrovaného pacienta.

Diagnostický testovací systém ELISA na detekciu protilátok proti HIV – zahŕňa vírusový antigén adsorbovaný na nosiči, protilátky proti ľudskému Ig. Používa sa na sérodiagnostiku AIDS.

Liečba: použitie inhibítorov reverznej transkriptázy pôsobiacich na aktivované bunky. Liečivá sú deriváty tymidínu – azidotymidín a fosfazid.

Prevencia. Špecifické - nie.

Vplyv fyzikálnych a chemických faktorov na mikróby. Mutácia a jej význam pre praktickú medicínu. Príklady. Hodnota ekológie.

Pôsobenie chemikálií a biologické faktory.

Pôsobenie chemikálií

Chemikálie môžu inhibovať alebo úplne inhibovať rast mikroorganizmov. Ak Chemická látka inhibuje rast baktérií, ale po odstránení sa ich rast opäť obnoví.

Antimikrobiálne činidlá, berúc do úvahy chemickú štruktúru a mechanizmus ich baktericídneho pôsobenia na baktérie, možno rozdeliť do nasledujúcich skupín: oxidačné činidlá, halogény, zlúčeniny kovov, kyseliny a zásady, povrchovo aktívne látky, alkoholy, farbivá, fenol a deriváty formaldehydu.

Oxidačné činidlá. Táto skupina zahŕňa peroxid vodíka a manganistan draselný.

Halogény. Chlór, jód a prípravky z nich: bielidlo, chloramín B, pantocid, liehový roztok jódu 5 %, jódinol, jódform.

Zlúčeniny ťažkých kovov (soli olova, medi, zinku, striebra, ortuti; organokovové zlúčeniny striebra: protargol, collargol). Tieto zlúčeniny sú schopné mať ako antimikrobiálne, tak rôzne lokálne účinky na tkanivá makroorganizmu.

Kyseliny a zásady. Baktericídne pôsobenie kyselín a zásad je založené na dehydratácii mikroorganizmov, zmenách pH živného média, hydrolýze koloidných systémov a tvorbe kyslých alebo alkalických albuminátov.

Farbivá majú vlastnosti, ktoré inhibujú rast baktérií. Konajú pomaly, ale selektívnejšie.

Formaldehyd je bezfarebný plyn. V praxi sa používa 40 %. vodný roztok formaldehyd (formalín). Formaldehyd plynný a rozpustený vo vode má škodlivý účinok na vegetatívne a spórové formy baktérií.

Pôsobenie biologických faktorov

Pôsobenie biologických faktorov sa prejavuje predovšetkým v antagonizme mikróbov, kedy odpadové produkty niektorých mikróbov spôsobujú smrť iných.

Antibiotiká (z gréckeho anti - proti, bios - život) - biologicky aktívne látky vznikajúce počas života húb, baktérií, živočíchov, rastlín a vytvorené synteticky, schopné selektívne potláčať a zabíjať mikroorganizmy, plesne, rickettsie, veľké vírusy, prvoky a jednotlivých helmintov.

3. Reakcia biologickej aktivity bakteriálnych enzýmov pri reumatizme, diagnostický a praktický význam, ochranná úloha protilátok proti enzýmom pri získanej imunite (stanovenie anti-hyaluronidázy a anti-O-streptolyzínu).

Reuma - bežné ochorenie infekčno-alergickej povahy, pri ktorej postihuje spojivové tkanivo, hlavne kardiovaskulárneho systému ako aj kĺby, vnútorné orgány, centrálna nervový systém. Predpokladá sa, že príčinou rozvoja reumatizmu je aktivácia patogénnych mikroorganizmov, najmä beta-hemolytického streptokoka skupiny A. Práve on hrá hlavnú úlohu v etiológii a patogenéze reumatického ochorenia. Po prvé, choroba sa vyvíja na pozadí streptokokovej infekcie. Po druhé, v krvi pacientov, veľké množstvo protilátky proti tejto skupine mikroorganizmov. Po tretie, prevencia ochorenia sa úspešne uskutočňuje antibakteriálnymi liekmi.

O reumatoidná artritída synoviálne membrány z neznámych dôvodov vylučujú veľké množstvá enzýmu glukózo-6-fosfátdehydrogenázy, ktorý tiež rozkladá disulfidové väzby v bunková membrána. Dochádza k "úniku" proteolytické enzýmy z bunkových lyzozómov, ktoré spôsobujú poškodenie blízkych kostí a chrupaviek. Telo reaguje produkciou cytokínov, medzi ktoré patrí aj tumor nekrotizujúci faktor α TNF-α. Kaskády reakcií v bunkách, ktoré sú spúšťané cytokínmi, ďalej zhoršujú symptómy ochorenia. Chronický reumatoidný zápal spojený s TNF-α veľmi často spôsobuje poškodenie chrupaviek a kĺbov vedúce k fyzickému postihnutiu.

REEF

Imunofluorescenčná reakcia je založená na interakcii antichlamýdiových protilátok s rodovo špecifickým chlamýdiovým antigénom. Existujú dva typy imunofluorescenčnej reakcie - priama a nepriama. V prvom prípade priamo špecifická protilátka značené fluorochrómom a reakcia prebieha v jednom štádiu, čo výrazne skracuje čas štúdie. V druhom prípade je špecifická protilátka neznačená a na detekciu AG-AT komplexu vytvoreného v prvej fáze sa používajú druhé značené protilátky špecifické pre antichlamýdiové protilátky. Výsledok reakcie sa vyhodnotí vizuálne pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Okrem dovážaných sa objavili domáce súpravy na diagnostiku chlamýdiovej infekcie priamou imunofluorescenčnou reakciou, ktoré prakticky nie sú horšie v špecifickosti a citlivosti, ale majú oveľa nižšiu cenu.

Podkladom pre štúdium sú odtlačky, pripravené v súlade s pravidlami. Nátery pre RIF sa pripravujú na špeciálnych odfarbených sklách v obmedzenej oblasti s priemerom 8 - 10 mm. Potom sa sušia na vzduchu a fixujú ponorením do studeného 96% (najlepšie absolútneho) etylalkoholu na 5–10 minút alebo aplikáciou 0,1–0,15 ml vychladeného bezvodého acetónu na prípravok, kým sa úplne neodparí. Fixované preparáty je možné ihneď vyšetriť alebo v prípade potreby skladovať pri izbovej teplote jeden deň alebo pri -20 °C po dobu 2 týždňov (v tomto prípade je potrebné vylúčiť vlhkosť počas skladovania a pred vyšetrením zohriať preparát na izbovú teplotu plastové vrecko a silikagél).

Pri vykonávaní priameho RIF sa na prípravok aplikuje roztok značených protilátok v množstve potrebnom na úplné pokrytie náteru (25 - 30 μl). Liečivo sa inkubuje v horizontálnej polohe vo vlhkej komore počas 15 minút pri teplote +37 °C. Sušenie činidla je neprijateľné, aby sa predišlo falošne pozitívnym výsledkom. Potom sa náter premyje v tečúcej vode počas 30 sekúnd, opláchne sa v destilovanej vode, vysuší sa a pripraví sa na mikroskopiu.

Pri vykonávaní nepriameho RIF sa liek aplikuje požadované množstvo roztoku antichlamýdiových protilátok a vykonajte prvú inkubáciu za rovnakých podmienok ako pri priamom RIF. Potom sa liek premyje, suší na vzduchu a aplikuje sa druhé činidlo - značené protilátky proti chlamýdiovým protilátkam a druhá inkubácia sa tiež uskutočňuje vo vlhkej komore pri +37 °C počas 15 minút. Po premytí sa prípravok vysuší a pripraví na mikroskopiu. Hotové prípravky sa odporúčajú okamžite prezrieť. V prípade potreby je možné morené prípravky skladovať 1-2 dni pri +2-8°C na tmavom mieste bez vlhkosti.

Mikroskopia sa vykonáva pomocou ponorného systému. Existujú dve možnosti pre ponornú mikroskopiu:

1. Olejová imerzia: 20 - 25 µl montážnej kvapaliny (glycerol tlmený fosfátovým tlmivým roztokom pH 7,2 - 7,6) sa nanesie na hotový vysušený prípravok prekrytý odtučneným krycím sklíčkom, na ktorý sa nanesie kvapka nefluorescenčného imerzného oleja. sa potom aplikuje a mikroskopuje s objektívom (označenie „L “ - luminiscenčný) so zväčšením 90 a okulárom so zväčšením 5.

2. Ponorenie do vody: na hotový prípravok sa nanesie kvapka 20 µl fosfátového tlmivého roztoku s pH 7,4 a mikroskopuje sa s objektívom na ponorenie do vody (označenie - biely pruh a “L” - luminiscenčné) so zväčšením 60 a okulárom so zväčšením 5. Ponorenie do vody poskytuje rovnomernejšie, jasnejšie a jasnejšie žiarenie.

RIF umožňuje detekovať antigénne štruktúry elementárnych aj retikulárnych teliesok. EB sú umiestnené prevažne extracelulárne, zaobleného tvaru s hladkými okrajmi, malé (veľkosť 1:100 - 1:150 vo vzťahu k bunkám, ktoré ich obklopujú), homogénna štruktúra, majú jasnú špecifickú smaragdovozelenú žiaru, ktorá pri práci s mikroskrutkou , môže poskytnúť difrakčné krúžky (krúžky Dealership). RT sú oveľa zriedkavejšie, nachádzajú sa hlavne intracelulárne, majú menej homogénnu štruktúru, sú viac polymorfné, ale majú aj jasné okraje a jasnú špecifickú smaragdovozelenú žiaru. Akýkoľvek iný fluorescenčný materiál nepravidelného tvaru s nerovnými, neostrými okrajmi, matne zelenou farbou alebo žiarou inej farby sa vzťahuje na artefakty. Intenzita, jas a odtieň špecifickej žiary závisí od pH upevňovacej kvapaliny alebo pufra použitého na mikroskopiu. Vysoká intenzita FITC luminiscencie v alkalickom médiu zvyšuje citlivosť metódy, ale vedie k zvýšeniu počtu objektov s nešpecifickou luminiscenciou a následne k falošne pozitívnym výsledkom. V kyslom prostredí sa intenzita FITC žiary znižuje, čo môže viesť k falošne negatívnym výsledkom. Sprievodná mikroflóra, ako aj jadrá okolitých buniek sú nešpecificky sfarbené do rôznych odtieňov. oranžová farba bromid indium, ich cytoplazma - v rôznych odtieňoch tehlovohnedej Evansovej modrej.

Na získanie spoľahlivého výsledku sa odporúča zobraziť veľa zorných polí lieku. Výsledok sa považuje za pozitívny, ak liek obsahuje epiteliálne bunky a je možné zistiť aspoň 6 elementárnych teliesok, ktoré majú všetky vyššie uvedené vlastnosti.

Detekcia menšieho množstva patogénu robí výsledok pochybným a vyžaduje si opätovné vyšetrenie, najlepšie na pozadí provokácie (jedlo - alkohol, lieky - injekcia pyrogenalu, mechanická - masáž močovej trubice na bougie). Kontrola vyliečenia by sa mala vykonať najskôr o dva týždne, pretože je možné zadržať neeliminovaný antigénny materiál neživotaschopného patogénu, čo bude dávať falošne pozitívne výsledky. Získanie 3 negatívnych výsledkov testov u mužov do mesiaca a u žien do 3 menštruačné cykly, neprítomnosť klinické prejavy chlamýdiová infekcia naznačuje zotavenie.

RIF at správna príprava pacient podľa pravidiel odberu materiálu a nastavenia reakcie je vysoko citlivá a špecifická metóda diagnostiky urogenitálnych chlamýdií a umožňuje identifikovať patogén u 90-95% pacientov. Táto metóda relatívne lacné, ľahko vykonateľné, vysoko informatívne, nevyžaduje špeciálne drahé vybavenie, umožňuje rýchlo získať výsledok (0,5 - 1 hodinu) a vizuálne kontrolovať kvalitu odberu materiálu na výskum.

Metódy využívajúce princípy molekulárnej biológie

Do skupiny patria metódy DNA sond a polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktoré umožňujú identifikovať genetický materiál patogén v študovanom biomateriáli. Súpravy na diagnostiku chlamýdií pomocou DNA sond sú stále v štádiu vývoja a klinických testov.

PCR sa aktívne zavádza do praxe laboratórna diagnostika. Metóda je založená na izolácii špecifickej sekvencie DNA alebo RNA patogénu pomocou komplementárnych primerov, jej následnom viacnásobnom kopírovaní a akumulácii pre ďalšiu detekciu konvenčnými detekčnými metódami (elektroforéza alebo ELISA). Táto metóda má vysokú špecifickosť a citlivosť, ktorá sa takmer približuje ku kultúrnej, a umožňuje odhaliť jednotlivé patogény v skúmanom materiáli. Metóda PCR si vyžaduje špeciálne drahé vybavenie, samostatné špeciálne vybavené laboratórium, primerané školenie a vysokú kvalifikáciu zdravotníckeho personálu. Zároveň nám nedovoľuje nedostatok certifikácie primerov používaných v Rusku a dostatočné skúsenosti s používaním metódy PCR, špecifickosť testovaného materiálu, jeho častá kontaminácia sprievodnou mikroflórou (ktorá môže poskytnúť falošne pozitívne výsledky). jednoznačne posúdiť jeho hodnotu v diagnostike urogenitálnych chlamýdií.

V súčasnosti je teda najdostupnejšou, najjednoduchšou a zároveň vysoko informatívnou metódou diagnostiky urogenitálnych chlamýdií a nastolenia liečby priama imunofluorescenčná reakcia (RIF). Kontrola dynamiky priebehu ochorenia a účinnosti liečby by sa mala vykonávať stanovením titra antichlamýdiových protilátok v krvnom sére pomocou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA).